אפיון פונקציונלי והדמיה של פיברובלסטים בוושט באמצעות תרביות אורגנואידים

ניסויים בבעלי חיים למחקר זה אושרו על ידי Stockholms Norra djurförsöksetiska nämnd (היתר אתי מספר 14051-2019). בעלי החיים שוכנו בתנאים נטולי פתוגנים על פי המלצות הפדרציה האירופית למדעי חיות המעבדה. 1. הכנה הפשירו את תמיסות המניות האנזימטיות המשמשות לדיסוציאציה (ראו טבלת חומרים) על קרח. הפשרת אליקוט של מטריצת קרום מרתף מופחתת גורם גדילה (GFR) (מטריצה) ב 4 ° C. הכינו את מדיום התרבות. השתמש במדיום המתואר בטבלה 1 עבור תרביות אורגנואידים ותרביות משותפות והכן אותו לפני תחילת הפרוטוקול. 2. דיסקציה והפרדה של אפיתל הוושט וסטרומה הערה: ודא שכל המכשירים המשמשים לדיסקציה ולעיבוד רקמות הם סטריליים. הכינו 2 מ”ל של תמיסת דיסוציאציה (ראו טבלת חומרים) בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) לכל שלושה ושט. השתמש בזן עכבר לבחירה, כגון עכברי C57BL/6J. התפתחות הוושט בעכברים מסתיימת לאחר יום הלידה (עמ’ 70), ולכן מומלץ להשתמש בעכברים שגילם עולה על p7013. השתמש בארבעה או חמישה עכברים מכיוון שהם מספקים מספיק חומר כדי ליצור 8-10 תרביות אורגנואידים.הערה: יעילות יצירת אורגנואידים יורדת עם גיל העכברים. אם תת-אוכלוסיות פיברובלסטים ספציפיות מעניינות, ייתכן שהתנובה הפיברובלסטית הנמוכה מגבילה את מספר התרביות האורגנואידיות שניתן להקים. השתמש בעכברים מהונדסים גנטית (למשל, PdgfrαH2BeGFP) או מסוג בר (WT) לבידוד אוכלוסיות פיברובלסטים. בעת שימוש בעכברי WT, בצע צביעת נוגדנים כדי לבודד תת-אוכלוסיות פיברובלסטים ספציפיות מהסטרומה באמצעות FACS. הרדימו את העכברים על ידי חנקCO2 . לנתח את הוושט באמצעות מלקחיים ומספריים דיסקציה. כדי להסיר את כל הוושט, לחתוך את הקצה הדיסטלי של הוושט ישירות מעל הבטן ואת הקצה הפרוקסימלי בתחילת קנה הנשימה. לטבול את הוושט PBS ולשים אותו על קרח. הסר באופן מכני את השרירים החיצוניים באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה (טווח הגדלה כולל של 8x-40x) ומלקחיים. החזיקו את הקצה הדיסטלי של הוושט המנותח באמצעות זוג מלקחיים אחד והשתמשו במלקחיים האחרים כדי לתפוס ולמשוך את השריר מהקצה הדיסטלי לקצה הפרוקסימלי של הוושט המנותח. הסר והשלך את שכבת השריר. פתח את הוושט לאורך. זה עובד הכי טוב באמצעות מספריים קפיציים microdissection עם קצה כדור כדי למנוע נזק לרקמות. החזיקו בקצה אחד של הוושט על מנת להכניס את כדור מספריים הקפיץ לתוך לומן הוושט וחתכו את הוושט תוך אחיזה עד הסוף. מניחים את הוושט בצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ”ל או בצלחת בת 24 בארות. יש לדגור על הוושט הפתוח בתרמוליזין של 0.5 מ”ג/מ”ל ב-HBSS בטמפרטורה של 37°C על שייקר נדנדה למשך 15 דקות. לטבול את הוושט לחלוטין בתמיסת תרמוליזין.הערה: נפח תמיסת התרמוליזין בשימוש תלוי בגודל הבאר או הצינור. מספר ושט ניתן להציב ולשקוע באותה באר או צינור. מוציאים את הוושט מתמיסת התרמוליזין. השתמש במיקרוסקופ דיסקציה כדי להפריד בזהירות את אפיתל הוושט מן הסטרומה. בעזרת מלקחיים עדינים, תופסים גם את צד האפיתל וגם את צד הסטרומה של הרקמה ומפרידים אותם לאט לאט כדי להפריד בין שתי השכבות.הערה: הסטרומה מזוהה על ידי המראה הלבן והאטום שלה, בניגוד לאפיתל השקוף. הסטרומה מכילה את הלמינה פרופריה ואת השכבה התת-רירית. מעבירים את שכבת האפיתל והסטרומה לשני צינורות מיקרו-צנטריפוגות נפרדים של 1.5 מ”ל עם 200 מיקרוליטר של תמיסת דיסוציאציה ב- HBSS. שים על קרח. 3. בידוד תאי אב של הוושט הערה: בידוד תאי אב של הוושט (שלב 2) ופיברובלסטים (שלב 3) יכול להתבצע בו זמנית. הכינו צינור 50 מ”ל של 1% FBS ב- HBSS (1% FBS). מעבירים את אפיתל הוושט המופרד מצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ”ל (שלב 2.8) לצלחת פטרי נקייה ומשתמשים באזמל חד לטחינה. אספו את הרקמה הטחונה מצלחת הפטרי עם 200 מיקרוליטר של תמיסת דיסוציאציה והעבירו אותה חזרה לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ”ל.הערה: האפיתל נטחן כראוי כאשר ניתן להחזיר את החתיכות לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ”ל באמצעות קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר. הוסף 800 μL של תמיסת דיסוציאציה טרייה לצינור מיקרו-צנטריפוגה 1.5 מ”ל לנפח כולל של 1 מ”ל.הערה: חשוב להוסיף נפח מספיק של פתרון דיסוציאציה. לכל אחד עד שלושה esophagi, 1 מ”ל של פתרון מומלץ. להגדיל כאשר יותר ושט מעובדים בבת אחת. הניחו את הצינור עם שכבת האפיתל הטחון על נדנדה-שייקר בטמפרטורה של 37°C למשך 60 דקות. פיפטה את התמיסה למעלה ולמטה בערך 20 פעמים באמצעות קצה פיפטה 200 μL כל 15 דקות כדי לשפר את העיכול. לאחר 60 דקות, פיפטה מעלה ומטה עוד 20 פעמים באמצעות קצה פיפטה 200 μL. העבירו את התמיסה דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ”ל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.הערה: יש להרטיב את מסננת התאים עם FBS של 1% לפני מאמץ התאים כדי למזער את היצמדות התאים למסנן. האפיתל לא יעוכל לחלוטין, וחתיכות רקמה עדיין יהיו גלויות. עם זאת, דגירה ארוכה יותר תפחית את הישרדות התאים ולא תביא לתנובה גבוהה יותר של תאים בני קיימא. יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי הסרת נוזל עודף עם פיפטה של 1 מ”ל ולהשהות מחדש את הגלולה ב-1 מ”ל של 1% FBS. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.במהלך הצנטריפוגה, להכין את תערובת נוגדנים מצומדים עבור FACS של תאי אב הוושט. ערבב 1 μL של CD324-PE-Cy7 (ECADHERIN) ו- CD104-A647 (INTEGRIN-β4) ב- 200 μL של 1% FBS לכל מיליון תאים.הערה: 1 μL של נוגדן (200 μL נפח סופי) מספיק עבור אחד או שניים esophagi. בעת עיבוד יותר ושט בבת אחת, להגדיל את נפח הפתרון מכתים נוגדנים. להשהות את הגלולה ב 200 μL של תערובת נוגדנים ולהעביר ציטומטריה זרימה ציטומטריה. לאחר הוספת נוגדנים פלואורסצנטיים, שמור על מתלי התאים בחושך כדי למנוע הלבנה של האות. לדגור על התאים במשך 30 דקות ב 4 ° C. הוסף 3 מ”ל של 1% FBS וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן להשעות מחדש את התאים במינימום של 200 μL של 1% של FBS.הערה: 500 μL של 1% FBS משמש עד ארבע או חמש ושט. הגדל את הנפח כאשר יותר ושט מעובדים בבת אחת, כך קצב זרימת FACS של 100-300 אירועים / s ניתן להשיג. יותר אירועים/ים יפחיתו את יעילות המיון, ועלייה בקצב הזרימה תקטין את הישרדות התא. הוסף סמן כתמים של תאים מתים לריכוז סופי של 1:10,000, 5 דקות לפני מיון FACS לבידוד תאים חיים. מיין את תאי האב באמצעות מכשיר FACS (ראה איור 1 עבור אסטרטגיית gating). אספו את התאים בצינורות מיקרו-צנטריפוגות בנפח 1.5 מ”ל המלאים ב-200 מיקרוליטר של תווך אורגנואיד בסיסי (טבלה 1). 4. בידוד פיברובלסטים משכבת הסטרומה חותכים את שכבת הסטומל לחתיכות עדינות בצינור של 1.5 מ”ל המכיל 200 מיקרוליטר של תמיסת דיסוציאציה (שלב 2.8) באמצעות מספריים לדיסקציה. הרקמה נטחנת כראוי ברגע שניתן להעלות ולהוריד את התמיסה באמצעות קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר. הוסף 800 μL של תמיסת דיסוציאציה טרייה לצינור מיקרו-צנטריפוגה 1.5 מ”ל לנפח כולל של 1 מ”ל.הערה: חשוב להוסיף נפח מספיק של פתרון דיסוציאציה. לכל אחד עד שלושה esophagi, 1 מ”ל של פתרון מומלץ. להגדיל כאשר יותר ושט מעובדים בבת אחת. הניחו את הצינור על שייקר נדנדה בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות. לאחר 15 דקות, פיפטה את התמיסה למעלה ולמטה בערך 20 פעמים באמצעות קצה פיפטה 200 μL כדי לשפר את העיכול. לאחר 30 דקות של עיכול אנזימטי, פיפטה מעלה ומטה עוד 20 פעמים באמצעות קצה פיפטה 200 μL. מסננים את התמיסה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ”ל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.הערה: יש להרטיב את מסננת התאים עם FBS של 1% לפני מאמץ התאים כדי למזער את היצמדות התאים למסנן. יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי הסרת נוזל עודף עם פיפטה של 1 מ”ל ולהשהות מחדש את הגלולה ב-1 מ”ל של 1% FBS. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.הערה: בעת שימוש בזן עכבר מהונדס גנטית המכיל פיברובלסטים המסומנים בתווית פלורסנט, כתמי נוגדנים הם אופציונליים. אם אין צורך בכתמי נוגדנים, המשך לשלב 3.7 והעבר את הדגימה לציטומטריית זרימה.במהלך הצנטריפוגה, הכינו את תערובת הנוגדנים המצומדים לבידוד FACS של פיברובלסטים. ערבב 1 μL של CD26-APC (DPP4) ב 200 μL של 1% FBS לכל מיליון תאים.הערה: 1 μL של נוגדן מספיק עבור אחד או שניים esophagi. בעת עיבוד יותר ושט בבת אחת, להגדיל את נפח הפתרון מכתים נוגדנים. להשעות מחדש את הגלולה ב 200 μL של תערובת נוגדנים מצומדים ב 1% FBS ולהעביר ציטומטריה זרימה. לדגור על התאים במשך 30 דקות ב 4 ° C. הוסף 3 מ”ל של FBS 1% וצנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C. להשעות מחדש את התאים במינימום של 200 μL של 1% של FBS.הערה: 500 μL של 1% FBS משמש עד ארבע או חמש ושט. הגדל את הנפח כאשר יותר ושט מעובדים בבת אחת, כך קצב זרימה של 100-300 אירועים / s ניתן להשיג. יותר אירועים/ים יפחיתו את יעילות המיון, והגדלת קצב הזרימה תקטין את הישרדות התא. לאחר הוספת נוגדנים פלואורסצנטיים, יש לשמור על תרחיפים כהים כדי למנוע הלבנת אות. הוסף סמן כתמים של תאים מתים לריכוז סופי של 1:10,000, 5 דקות לפני מיון FACS לבידוד תאים חיים. מיין את התאים באמצעות מכשיר FACS (ראה איור 1 עבור אסטרטגיית gating). אספו את התאים בצינורות מיקרו-צנטריפוגות בנפח 1.5 מ”ל המלאים ב-200 מיקרוליטר של תווך אורגנואיד בסיסי (טבלה 1). 5. הקמה ותרבות של אורגנואידים בוושט הערה: Prewarm ERנמוך (תרבית משותפת אורגנואידים), ENR (אורגנואיד) בינוני (ראה טבלה 1 לתיאור), וצלחת 48 בארות ב 37 ° C. מניחים את המטריצה המופשרת (מוכנה בשלב 1) aliquot על קרח. מומלץ להשתמש במטריצה המסופקת כאן (ראה טבלת חומרים) עבור תרבית אורגנואידים של הוושט בעכבר, שכן מותגים אחרים של מטריצה משפיעים לרעה על יעילות יצירת אורגנואידים. עבור תרבית אורגנואידים, ערבבו את תאי האפיתל הממוינים והפיברובלסטים ביחס של 1:2 בצינור. עבור כל כיפת מטריצה, השתמש 5,000 תאי אפיתל ו 10,000 פיברובלסטים. כאשר מתכוננים לכיפות נוספות, יש להוסיף מכפלה של 5,000 תאי אפיתל ו-10,000 פיברובלסטים לצינור אחד. עבור תרביות אורגנואידים ללא פיברובלסטים, השתמש ב-5,000 תאי אפיתל לכל כיפת מטריצה. צנטריפוגה אוכלוסיית התאים המעורבים ב 300 x גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הסרתו בזהירות עם פיפטה של 200 מיקרוליטר. שטפו את התאים פעם אחת על ידי השעיית הגלולה בתווך אורגנואיד בסיסי קר וצנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 5 דקות. מניחים את התאים על קרח. הכינו תערובת המורכבת מ-80% מטריצה ו-20% מדיום אורגנואיד בסיסי קר. הניחו הכל על קרח כשהמטריצה מתמצקת בטמפרטורת החדר (RT). השליכו את הסופרנאטנט לאחר הצנטריפוגה על ידי הסרתו בזהירות עם פיפטה של 200 מיקרוליטר. מרחפים מחדש את התאים ב-10 מיקרוליטר של תערובת מטריצה / כיפה ומחזירים לקרח. קח את הצלחת המחוממת מראש של 48 בארות מאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס וצור כיפת מטריצה אחת לכל באר באמצעות פיפטה של 20 מיקרוליטר. כל כיפה מכילה 10 μL של 80% מטריצה, 5,000 תאי אפיתל ו-10,000 פיברובלסטים. מעבירים את הצלחת הפוכה לאינקובטור ונותנים לכיפות להתמצק עוד 20-30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.הערה: ירידה בנפח כיפת המטריצה ו/או עלייה במספר התאים ישפיעו על יעילות יצירת האורגנואידים. הוסף 200 μL של ERמחומם מראש בינוני נמוך (טבלה 1) לכיפות המטריצה המכילות תרביות אורגנואידים ותווך ENR (טבלה 1) לכיפות המטריצה המתאימות המכילות אורגנואידים אפיתליאליים בלבד ומקם את הצלחת באינקובטור. לגדל את האורגנואידים ב 37 ° C ו 5% CO2. במשך היומיים הראשונים, להשלים את המדיום עם 10 מיקרומטר מעכב סלע (Y-27623). מעכב סלעים מונע מוות תאי כתוצאה מלחץ ומגדיל את הסיכוי להקמה מוצלחת של תרביות אורגנואידים. רענן את המדיום כל 2-3 ימים. ודא שהתווך חם כדי למנוע דיסוציאציה של המטריצה הרגישה לטמפרטורה. בצע ניתוחים של הניסוי 6 עד 8 ימים לאחר הציפוי. ניתן לשמור את האורגנואידים בתרבית עד 14 יום. בסביבות היום ה-14 נצפה אובדן שלמות הכיפה. 6. מעבר של אורגנואידים הערה: העברה של אורגנואידים שגדלו בתרבית משותפת גורמת לאובדן פיברובלסטים. לכן, מומלץ להשתמש בתווך ENR עבור כל האורגנואידים בעת מעבר. חימום מראש של ENR, PBS וצלחת של 48 בארות ב-37°C. מוציאים את המדיום ושוטפים היטב את כיפת המטריקס עם PBS שחומם מראש. הוסף 200 μL של תמיסת טריפסין קרה 0.25% ופיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את כיפת המטריצה.הערה: מומלץ להשתמש בטריפסין 0.25% קר, מכיוון שהמטריצה רגישה לטמפרטורה וזה מסייע בפירוק כיפות המטריצה. לדגור על אורגנואידים עם טריפסין ב 37 ° C במשך ~ 20 דקות. פיפטה למעלה ולמטה לאחר 10 דקות כדי להגביר את הדיסוציאציה של האורגנואידים. עקוב אחר תהליך הדיסוציאציה במיקרוסקופ כל 5-10 דקות. מאחר שטריפסין מקטין את יכולת הקיום של התא, זה יכול לעזור לזהות את זמן הדיסוציאציה האידיאלי. לאחר 20 דקות, פיפטה את האורגנואידים למעלה ולמטה עם פיפטה 200 μL כדי לנתק את האורגנואידים. אסוף את התאים בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ”ל, הוסף 1 מ”ל של תווך אורגנואיד בסיסי, וצנטריפוגה ב -300 x גרם למשך 5 דקות ב- RT. אופציונלי: כדי להבטיח את תנאי הגידול הטובים ביותר של אורגנואידים ושאורגנואידים חדשים מופקים מתאים בודדים, סננו את התאים באמצעות מסננת תאים של 40 מיקרומטר שהורטבה מראש. סינון תרחיף התא גורם להסרת ליבות אורגנואידים וגושי תאים שקשה לנתק. הכינו תערובת מטריצה המורכבת מ-80% מטריצה ו-20% מדיום אורגנואיד בסיסי קר. הניחו הכל על קרח, כאשר המטריצה מתמצקת ב- RT. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הסרתו בזהירות עם פיפטה של 200 מיקרוליטר, השהו מחדש את התאים ב-10 מיקרוליטר של תערובת מטריצה / כיפה, והחזירו את התערובת לקרח.הערה: ניתן לפצל אורגנואידים ביחס של 1:5 עד 1:10, בהתאם לצפיפות הכיפה. ניתן גם לספור תאי אפיתל ולצפות אותם מחדש ב-5,000 תאים/כיפה. קח את צלחת 48 בארות שחוממה מראש מאינקובטור 37 מעלות צלזיוס ולעשות כיפה אחת לכל באר. מעבירים את הצלחת הפוכה לאינקובטור ונותנים לכיפות להתמצק עוד 20-30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף 200 μL של מדיום ENR שחומם מראש לכיפות האורגנואידים המתאימות. השלם את המדיום עם מעכב סלע 10 מיקרומטר (Y-27623) במשך היומיים הראשונים. רענן את המדיום כל 2-3 ימים. ודא שהתווך חם כדי למנוע דיסוציאציה של המטריצה הרגישה לטמפרטורה. 7. עיבוד אורגנואיד לצביעת הר שלם הערה: יש לצפות את הקצוות והצינורות ב-10% FBS ב-PBS לפני השימוש כדי למנוע הידבקות של אורגנואידים לפלסטיק. עבור קצוות פיפטה, מספיק פיפטה פעם או פעמיים למעלה ולמטה בתמיסת 10% FBS/PBS לפני השימוש בקצה. עבור צינורות, מלא את הצינור עם 10% FBS / PBS ולאחר מכן להסיר את התמיסה. הסר את התווך האורגנואידי והוסף 200 μL של PBS קר כקרח לכיפות המטריצה. מניחים את הצלחת על קרח למשך 5-10 דקות. פיפטה למעלה ולמטה ולהעביר את הפתרון 0.6 מ”ל מיקרו צנטריפוגות צינורות לא דבקים. צנטריפוגה זמן קצר במשך 30-60 שניות ב 100 x גרם כדי לתת אורגנואידים לשקוע בתחתית.הערה: עודף פיפטינג וצנטריפוגה ארוכה שוברים את האורגנואידים ומשבשים את האינטראקציה פיברובלסט-אורגנואידים. יש להסיר את עודפי הנוזלים ולהוסיף PBS קר כקרח. צנטריפוגה זמן קצר במשך 30-60 שניות ב 100 x גרם כדי לתת אורגנואידים לשקוע בתחתית. הסר את עודפי הנוזל וקבע את האורגנואיד עם 200 μL של פורמלדהיד קר 4% בתמיסת PBS למשך 30 דקות על קרח.אזהרה: פורמלדהיד הוא רעיל ויש להשתמש בו תמיד במנדף כימי. יש ללבוש תמיד כפפות ניטריל, משקפי בטיחות ומעילי מעבדה. קיבוע האורגנואיד גורם להם לשקוע, ואין עוד צורך בצנטריפוגה. תנו לאורגנואידים לשקוע על ידי הנחת הצינור זקוף והמתינו 2-3 דקות, הסירו את הפורמלדהיד והוסיפו 500 μL של PBS קר כדי לשטוף את הפורמלדהיד. תנו לאורגנואידים לשקוע, הסירו את עודפי PBS והוסיפו 500 מיקרוליטר של PBS קר טרי. תנו לאורגנואידים לשקוע, הסירו את עודפי PBS והוסיפו 500 μL של חיץ חוסם (5% סרום חמור רגיל, 1% BSA ו-0.5% Triton X-100 ב-PBS). הניחו את הצינור על נדנדה-שייקר למשך 60 דקות ב-RT.הערה: חסימה יכולה להיעשות גם בלילה (O/N) ב 4 ° C. תנו לאורגנואידים לשקוע, הסירו את המאגר החוסם, והשעו מחדש את האורגנואידים ב-200 מיקרוליטר של חיץ חוסם עם נוגדנים ראשוניים (ראו טבלת חומרים). שמור את האורגנואידים על מטלטל נדנדה O/N ב 4 ° C.הערה: כדי לשפר את הצביעה של חלבונים גרעיניים, חלבונים בעלי ביטוי נמוך או נוגדנים המראים צביעה לא ספציפית, ניתן להגדיל את זמן הדגירה למשך יום או יומיים ב -4 מעלות צלזיוס. הנחת האורגנואידים על נדנדה-שייקר היא חיונית מכיוון שהיא מונעת מאורגנואידים להתקבץ יחד ומגבירה את יעילות הצביעה. תן לאורגנואידים לשקוע, הסר את תערובת הנוגדנים הראשונית ושטוף את האורגנואידים באמצעות 500 μL של 0.02% Triton X-100 ב- PBS (0.02% Tx) למשך 60 דקות ב- RT. חזור על הפעולה שלוש פעמים.הערה: כאשר יש צורך בדגירה ארוכה יותר של נוגדנים ראשוניים, הוסף שלב שטיפה עם 0.02% Tx ב- PBS O/N ב- 4 ° C. הניחו לאורגנואידים לשקוע, הסירו את מאגר הכביסה והוסיפו 200 μL של נוגדן משני מצומד פלואורסצנטי בחסימת O/N ב-4°C. לאחר הוספת נוגדנים משניים פלואורסצנטיים, שמור את האורגנואידים בחושך כדי למנוע הלבנה של האות. תן לאורגנואידים לשקוע, הסר את תערובת הנוגדנים המשנית ושטוף את האורגנואידים באמצעות 500 μL של 0.02% Tx במשך 60 דקות ב- RT. חזור על הפעולה שלוש פעמים. הכתימו את האורגנואידים בתמיסת DAPI (0.25 מיקרוגרם/מ”ל) של 200 מיקרוליטר לצביעה גרעינית במידת הצורך. דגרו על הדגימות במשך 60 דקות ב-RT על נדנדה-שייקר. תן לאורגנואידים לשקוע, הסר תמיסת DAPI ושטוף את האורגנואידים ב 500 μL של PBS במשך 15 דקות ב- RT. חזור על הפעולה שלוש פעמים. תנו לאורגנואידים לשקוע והוציאו את כל עודפי הנוזלים. הוסף 10 μL של תמיסת ניקוי לאורגנואידים ודגר במשך 15 דקות ב- RT.הערה: תמיסת הסליקה צמיגית, לכן יש לחתוך את החלק החיצוני של קצה פיפטה של 20 μL לפני ביצוע תמיסת הסילוק. ניתן להוסיף פתרון ניקוי נוסף אם נעשה שימוש בספייסר גדול יותר להדמיה. ניתן להשתמש בתמיסת הרכבה במקום בתמיסת הסליקה כאשר לא מנקים את האורגנואידים. פתרון הניקוי מפחית את הרקע בעת ההדמיה ומגדיל את עומק ההדמיה. הניחו ספייסר דו-צדדי דביק בקוטר 4 בארות בקוטר 0.05 מ”מ על שקופית מיקרוסקופ. הוסף את 10 μL של תמיסת ניקוי עם האורגנואידים בבאר אחת ומניחים מחליק כיסוי על גבי הספייסר.הערה: ניתן גם להרכיב אורגנואידים ללא שימוש בספייסר. הספייסר שומר על צורת האורגנואיד שלמה ומונע שיטוח של האורגנואידים. השאר את השקופית ב- RT O/N כדי לנקות את האורגנואידים. לאחסון לטווח ארוך, שמור את המגלשות בטמפרטורה של 4°C. רכוש תמונות באמצעות מערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית.