Caracterización funcional y visualización de fibroblastos esofágicos mediante cocultivos organoides

Los experimentos con animales para este estudio fueron aprobados por Stockholms Norra djurförsöksetiska nämnd (permiso ético n.º 14051-2019). Los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos de acuerdo con las recomendaciones de la Federación Europea de la Asociación Europea de Ciencia de Animales de Laboratorio. 1. Preparación Descongelar las soluciones madre enzimáticas utilizadas para la disociación (ver Tabla de materiales) en hielo. Descongelar una alícuota de matriz de membrana basal reducida del factor de crecimiento (TFG) (matriz) a 4 °C. Preparar el medio de cultivo. Utilice el medio descrito en la Tabla 1 para cultivos organoides y cocultivos y prepárelo antes de comenzar el protocolo. 2. Disección y separación del epitelio esofágico y el estroma NOTA: Asegúrese de que todos los instrumentos utilizados para la disección y el procesamiento de tejidos sean estériles. Prepare 2 ml de solución de disociación (consulte la Tabla de materiales) en la solución salina balanceada de Hanks (HBSS) por tres esófagos. Use una cepa de ratón de su elección, como los ratones C57BL/6J. El desarrollo esofágico en ratones termina después del día postnatal (p) 70, por lo que se recomienda utilizar ratones mayores de p7013. Use cuatro o cinco ratones, ya que proporcionan suficiente material para establecer 8-10 cocultivos de organoides.NOTA: La eficiencia de formación de organoides disminuye con la edad de los ratones. Si las subpoblaciones específicas de fibroblastos son de interés, es posible que el bajo rendimiento de fibroblastos esté limitando el número de cocultivos de organoides que se pueden establecer. Utilice ratones modificados genéticamente (por ejemplo, PdgfrαH2BeGFP) o de tipo salvaje (WT) para el aislamiento de poblaciones de fibroblastos. Cuando se utilizan ratones WT, realizar tinción de anticuerpos para aislar subpoblaciones específicas de fibroblastos del estroma a través de FACS. Eutanasia a los ratones por asfixia deCO2 . Diseccionar el esófago con fórceps y tijeras de disección. Para extirpar todo el esófago, corte el extremo distal del esófago directamente por encima del estómago y el extremo proximal al comienzo de la tráquea. Sumerge el esófago en PBS y ponlo en hielo. Extirpar mecánicamente la muscular externa utilizando un microscopio de disección (rango de aumento total de 8x-40x) y fórceps. Sostenga el extremo distal del esófago disecado con un par de fórceps y use los otros fórceps para agarrar y tirar del músculo desde el extremo distal hasta el extremo proximal del esófago disecado. Retire y deseche la capa muscular. Abra el esófago longitudinalmente. Esto funciona mejor usando tijeras de resorte de microdisección con una punta de bola para evitar daños en los tejidos. Sostenga un extremo del esófago para insertar la bola de las tijeras de resorte en la luz del esófago y abra el esófago mientras se sostiene en el extremo. Coloque el esófago en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml o en una placa de 24 pocillos. Incubar el esófago abierto en 0,5 mg/ml de termolisina en HBSS a 37 °C en un balancín-agitador durante 15 min. Sumergir el esófago completamente en solución de termolisina.NOTA: El volumen de la solución de termolisina utilizada depende del tamaño del pozo o tubo. Se pueden colocar varios esófagos y sumergirlos en el mismo pozo o tubo. Saque el esófago de la solución de termolisina. Use un microscopio de disección para separar cuidadosamente el epitelio esofágico del estroma. Con pinzas finas, agarre tanto el lado epitelial como el lado del estroma del tejido y sepárelos lentamente para separar las dos capas.NOTA: El estroma se identifica por su aspecto blanco y opaco, en contraste con el epitelio transparente. El estroma contiene la lámina propia y la capa submucosa. Transfiera la capa epitelial y estromal a dos tubos de microcentrífuga separados de 1,5 ml con 200 μL de solución de disociación en HBSS. Poner en hielo. 3. Aislamiento de células progenitoras esofágicas NOTA: El aislamiento de células progenitoras esofágicas (paso 2) y fibroblastos (paso 3) se puede realizar simultáneamente. Prepare un tubo de 50 ml de FBS al 1% en HBSS (FBS al 1%). Transfiera el epitelio esofágico separado del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (paso 2.8) a una placa de Petri limpia y use un bisturí afilado para picar. Recoger el tejido picado de la placa de Petri con 200 μL de solución de disociación y transferirlo de nuevo al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.NOTA: El epitelio se pica correctamente cuando las piezas se pueden volver a colocar en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando una punta de pipeta de 200 μL. Añadir 800 μL de solución de disociación fresca al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml hasta un volumen total de 1 ml.NOTA: Es importante agregar un volumen suficiente de solución de disociación. Por uno a tres esófagos, se recomienda 1 ml de solución. Amplíe cuando se procesen más esófagos a la vez. Colocar el tubo con la capa epitelial picada en un balancín a 37 °C durante 60 min. Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 20 veces usando una punta de pipeta de 200 μL cada 15 minutos para mejorar la digestión. Después de 60 minutos, pipetear hacia arriba y hacia abajo otras 20 veces con una punta de pipeta de 200 μL. Pasar la solución a través de un filtro celular de 40 μm a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.NOTA: Moje el filtro celular con FBS al 1% antes de colar las células para minimizar la adherencia de las células al filtro. El epitelio no se digerirá completamente y los pedazos de tejido aún serán visibles. Sin embargo, una incubación más prolongada disminuirá la supervivencia celular y no dará como resultado un mayor rendimiento de células viables. Deseche el sobrenadante eliminando el exceso de líquido con una pipeta de 1 ml y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de FBS al 1%. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.Durante la centrifugación, preparar la mezcla de anticuerpos conjugados para el FACS de las células progenitoras esofágicas. Mezclar 1 μL de CD324-PE-Cy7 (ECADHERIN) y CD104-A647 (INTEGRIN-β4) en 200 μL de FBS al 1% por millón de células.NOTA: 1 μL de anticuerpo (200 μL de volumen final) es suficiente para uno o dos esófagos. Cuando procese más esófagos a la vez, aumente el volumen de la solución de tinción de anticuerpos. Resuspender el pellet en 200 μL de mezcla de anticuerpos y transferirlo a un tubo de citometría de flujo. Después de agregar anticuerpos fluorescentes, mantenga las suspensiones celulares en la oscuridad para evitar el blanqueamiento de la señal. Incubar las celdas durante 30 min a 4 °C. Añadir 3 ml de FBS al 1% y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C, y luego resuspender las células en un mínimo de 200 μL de 1% de FBS.NOTA: 500 μL de FBS al 1% se utilizan para hasta cuatro o cinco esófagos. Aumente el volumen cuando se procesan más esófagos a la vez, de modo que se pueda lograr una tasa de flujo FACS de 100-300 eventos / s. Más eventos disminuirán la eficiencia de clasificación, y un aumento en la tasa de flujo disminuirá la supervivencia celular. Agregue el marcador de tinción de células muertas a una concentración final de 1:10.000, 5 minutos antes de la clasificación del FACS para aislar las células vivas. Clasifique las células progenitoras utilizando una máquina FACS (consulte la Figura 1 para la estrategia de compuerta). Recoger las células en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml llenos de 200 μL de medio organoide básico (Tabla 1). 4. Aislamiento de fibroblastos de la capa estromal Cortar la capa estomal en trozos finos en un tubo de 1,5 ml que contenga 200 μL de solución de disociación (paso 2.8) utilizando tijeras de disección. El tejido se pica correctamente una vez que la solución se puede pipetear hacia arriba y hacia abajo utilizando una punta de pipeta de 200 μL. Añadir 800 μL de solución de disociación fresca al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml hasta un volumen total de 1 ml.NOTA: Es importante agregar un volumen suficiente de solución de disociación. Por uno a tres esófagos, se recomienda 1 ml de solución. Amplíe cuando se procesen más esófagos a la vez. Colocar el tubo en un balancín a 37 °C durante 30 min. Después de 15 minutos, pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 20 veces con una punta de pipeta de 200 μL para mejorar la digestión. Después de 30 minutos de digestión enzimática, pipetear hacia arriba y hacia abajo otras 20 veces con una punta de pipeta de 200 μL. Colar la solución a través de un filtro celular de 70 μm en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.NOTA: Moje el filtro celular con FBS al 1% antes de colar las células para minimizar la adherencia de las células al filtro. Deseche el sobrenadante eliminando el exceso de líquido con una pipeta de 1 ml y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de FBS al 1%. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.NOTA: Cuando se utiliza una cepa de ratón modificada genéticamente que contiene fibroblastos marcados con fluorescencia, las tinciones de anticuerpos son opcionales. Si no se requieren tinciones de anticuerpos, continúe con el paso 3.7 y transfiera la muestra a un tubo de citometría de flujo.Durante la centrifugación, preparar la mezcla de anticuerpos conjugados para el aislamiento de fibroblastos por FACS. Mezclar 1 μL de CD26-APC (DPP4) en 200 μL de FBS al 1% por millón de células.NOTA: 1 μL de anticuerpo es suficiente para uno o dos esófagos. Cuando procese más esófagos a la vez, aumente el volumen de la solución de tinción de anticuerpos. Resuspender el pellet en 200 μL de mezcla de anticuerpos conjugados en FBS al 1% y transferir a un tubo de citometría de flujo. Incubar las celdas durante 30 min a 4 °C. Añadir 3 ml de FBS al 1% y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Resuspender las células en un mínimo de 200 μL de 1% de FBS.NOTA: 500 μL de FBS al 1% se utilizan para hasta cuatro o cinco esófagos. Aumente el volumen cuando se procesan más esófagos a la vez, de modo que se pueda lograr una tasa de flujo de 100-300 eventos / s. Más eventos/s disminuirán la eficiencia de clasificación, y el aumento de la tasa de flujo disminuirá la supervivencia celular. Después de agregar anticuerpos fluorescentes, las suspensiones celulares deben mantenerse oscuras para evitar el blanqueamiento de la señal. Agregue el marcador de tinción de células muertas a una concentración final de 1:10.000, 5 minutos antes de la clasificación del FACS para aislar las células vivas. Ordene las celdas utilizando una máquina FACS (consulte la Figura 1 para conocer la estrategia de compuerta). Recoger las células en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml llenos de 200 μL de medio organoide básico (Tabla 1). 5. Establecimiento y cultivo de organoides esofágicos NOTA: Precaliente ERbajo (cocultivo de organoides), medio ENR (organoide) (ver Tabla 1 para la descripción) y una placa de 48 pocillos a 37 °C. Coloque la matriz descongelada (preparada en el paso 1) alícuota sobre hielo. Se recomienda utilizar la matriz proporcionada aquí (consulte la Tabla de materiales) para el cultivo de organoides esofágicos de ratón, ya que otras marcas de matriz afectan negativamente la eficiencia de formación de organoides. Para el cocultivo de organoides, mezclar las células epiteliales y fibroblastos clasificados en una proporción de 1:2 en un tubo. Para cada cúpula de matriz, utilice 5.000 células epiteliales y 10.000 fibroblastos. Cuando se prepare para más domos, agregue un múltiplo de 5,000 células epiteliales y 10,000 fibroblastos a un tubo. Para cultivos organoides sin fibroblastos, utilizar 5.000 células epiteliales por cúpula de matriz. Centrifugar la población celular mixta a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante retirándolo cuidadosamente con una pipeta de 200 μL. Lavar las células una vez resuspendiendo el pellet en medio organoide básico frío y centrifugar a 300 x g durante 5 min. Coloque las celdas en hielo. Preparar una mezcla compuesta por un 80% de matriz y un 20% de medio organoide básico frío. Coloque todo en hielo a medida que la matriz se solidifica a temperatura ambiente (RT). Deseche el sobrenadante después de la centrifugación retirándolo cuidadosamente con una pipeta de 200 μL. Resuspender las células en 10 μL de mezcla de matriz/cúpula y volver a ponerlas en hielo. Tome la placa precalentada de 48 pocillos de la incubadora a 37 °C y haga una cúpula de matriz por pocillo con una pipeta de 20 μL. Cada domo contiene 10 μL de matriz al 80%, 5.000 células epiteliales y 10.000 fibroblastos. Transfiera la placa boca abajo a una incubadora y deje que los domos se solidifiquen durante otros 20-30 minutos a 37 ° C.NOTA: Una disminución en el volumen de la cúpula de la matriz y / o un aumento en el número de células afectará la eficiencia de formación de organoides. Agregue 200 μL de ERbajo medio precalentado (Tabla 1) a las cúpulas matriciales que contienen cocultivos organoides y medio ENR (Tabla 1) a las respectivas cúpulas de matriz que contengan solo organoides epiteliales y coloque la placa en la incubadora. Cultivar los organoides a 37 °C y 5% deCO2. Durante los primeros 2 días, complemente el medio con un inhibidor de roca de 10 μM (Y-27623). El inhibidor de roca previene la muerte celular inducida por estrés y aumenta la posibilidad de un establecimiento exitoso de cultivos de organoides. Actualice el medio cada 2-3 días. Asegúrese de que el medio esté caliente para evitar la disociación de la matriz sensible a la temperatura. Realizar análisis del experimento de 6 a 8 días después del enchapado. Los organoides se pueden mantener en cultivo hasta por 14 días. Alrededor del día 14, se observa pérdida de la integridad del domo. 6. Transmisión de organoides NOTA: El paso de organoides cultivados en cocultivo resulta en la pérdida de fibroblastos. Por lo tanto, se recomienda utilizar medio ENR para todos los organoides cuando se pasan. Precaliente ENR, PBS y una placa de 48 pocillos a 37 °C. Retire el medio y lave el pozo que contiene la cúpula de la matriz con PBS precalentado. Añadir 200 μL de solución fría de tripsina al 0,25% y pipetear hacia arriba y hacia abajo para romper la cúpula de la matriz.NOTA: Se recomienda el uso de tripsina fría al 0,25%, ya que la matriz es sensible a la temperatura y esto ayuda a descomponer las cúpulas de la matriz. Incubar los organoides con tripsina a 37 °C durante ~20 min. Pipetear hacia arriba y hacia abajo después de 10 minutos para aumentar la disociación de los organoides. Monitoree el proceso de disociación con un microscopio cada 5-10 min. Dado que la tripsina disminuye la viabilidad celular, esto puede ayudar a identificar el tiempo de disociación ideal. Después de 20 minutos, pipetear los organoides hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 200 μL para disociar los organoides. Recoja las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, agregue 1 ml de medio organoide básico y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a RT. Opcional: Para garantizar las mejores condiciones de crecimiento de organoides y que los nuevos organoides se deriven de células individuales, cuele las células a través de un filtro celular prehumedecido de 40 μm. El filtrado de la suspensión celular da como resultado la eliminación de núcleos de organoides y grupos celulares que son difíciles de disociar. Preparar una mezcla matricial compuesta por 80% de matriz y 20% de medio organoide básico frío. Coloque todo en hielo, ya que la matriz se solidifica en RT. Deseche el sobrenadante retirándolo cuidadosamente con una pipeta de 200 μL, resuspenda las células en 10 μL de mezcla/cúpula de matriz y vuelva a poner la mezcla en hielo.NOTA: Los organoides se pueden dividir en una proporción de 1:5 a 1:10, dependiendo de la densidad del domo. Las células epiteliales también se pueden contar y volver a colocar en 5.000 células / domo. Tome la placa precalentada de 48 pocillos de la incubadora a 37 °C y haga una cúpula por pocillo. Transfiera la placa boca abajo a una incubadora y deje que los domos se solidifiquen durante otros 20-30 minutos a 37 ° C. Añadir 200 μL de medio ENR precalentado a las cúpulas organoides respectivas. Complementar el medio con 10 μM Rock-inhibitor (Y-27623) durante los primeros 2 días. Actualice el medio cada 2-3 días. Asegúrese de que el medio esté caliente para evitar la disociación de la matriz sensible a la temperatura. 7. Procesamiento de organoides para tinción de montaje completo NOTA: Cubra las puntas y los tubos con un 10% de FBS en PBS antes de usarlos para evitar que los organoides se adhieran a los plásticos. Para las puntas de pipeta, es suficiente pipetear una o dos veces hacia arriba y hacia abajo en una solución FBS/PBS al 10% antes de usar la punta. Para los tubos, llene el tubo con 10% de FBS / PBS y luego retire la solución. Retire el medio organoide y agregue 200 μL de PBS helado a las cúpulas de la matriz. Coloque el plato en hielo durante 5-10 min. Pipetear hacia arriba y hacia abajo y transferir la solución a tubos no adherentes de microcentrífuga de 0,6 ml. Centrifugar brevemente durante 30-60 s a 100 x g para que los organoides se asienten en el fondo.NOTA: El exceso de pipeteo y la centrifugación larga rompen los organoides e interrumpen la interacción fibroblasto-organoide. Retire el exceso de líquido y agregue PBS helado. Centrifugar brevemente durante 30-60 s a 100 x g para que los organoides se asienten en el fondo. Retire el exceso de líquido y fije el organoide con 200 μL de formaldehído frío al 4% en solución PBS durante 30 minutos en hielo.PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico y siempre debe usarse en una campana extractora de humos químicos. Siempre se deben usar guantes de nitrilo, gafas de seguridad y batas de laboratorio. La fijación del organoide hace que se hundan, y la centrifugación ya no es necesaria. Deje que los organoides se hundan colocando el tubo en posición vertical y espere 2-3 minutos, retire el formaldehído y agregue 500 μL de PBS frío para eliminar el formaldehído. Deje que los organoides se hundan, retire el exceso de PBS y agregue 500 μL de PBS fresco y frío. Deje que los organoides se hundan, elimine el exceso de PBS y agregue 500 μL de tampón de bloqueo (5% de suero de burro normal, 1% de BSA y 0.5% de Triton X-100 en PBS). Coloque el tubo en un balancín durante 60 minutos en RT.NOTA: El bloqueo también se puede realizar durante la noche (O/N) a 4 °C. Deje que los organoides se hundan, retire el tampón de bloqueo y resuspenda los organoides en 200 μL de tampón de bloqueo con anticuerpos primarios (consulte la Tabla de materiales). Mantener los organoides en un agitador balancín O/N a 4 °C.NOTA: Para mejorar la tinción de proteínas nucleares, proteínas de baja expresión o anticuerpos que muestran tinción inespecífica, el tiempo de incubación puede aumentarse durante 1 o 2 días a 4 °C. Colocar los organoides en un balancín-agitador es esencial, ya que evita que los organoides se agrupen y aumenta la eficiencia de la tinción. Deje que los organoides se hundan, retire la mezcla de anticuerpos primarios y lave los organoides usando 500 μL de Triton X-100 al 0,02% en PBS (0,02% Tx) durante 60 minutos a RT. Repita tres veces.NOTA: Cuando se necesite una incubación de anticuerpos primarios más prolongada, agregue un paso de lavado con 0.02% de Tx en PBS O/N a 4 °C. Deje que los organoides se hundan, retire el tampón de lavado y agregue 200 μL de anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia en el tampón de bloqueo O/N a 4 °C. Después de agregar anticuerpos secundarios fluorescentes, mantenga los organoides en la oscuridad para evitar el blanqueamiento de la señal. Deje que los organoides se hundan, retire la mezcla de anticuerpos secundarios y lave los organoides con 500 μL de Tx al 0,02% durante 60 minutos a RT. Repita tres veces. Contrarrestar la tinción de los organoides con 200 μL de solución DAPI (0,25 μg/ml) para la tinción nuclear si es necesario. Incubar las muestras durante 60 minutos en RT en un balancín-agitador. Deje que los organoides se hundan, retire la solución DAPI y lave los organoides en 500 μL de PBS durante 15 minutos en RT. Repita tres veces. Deje que los organoides se hundan y elimine todo el exceso de líquido. Añadir 10 μL de solución de aclaramiento a los organoides e incubar durante 15 min a RT.NOTA: La solución de aclaramiento es viscosa, así que corte la parte exterior de una punta de pipeta de 20 μL antes de pipetear la solución de aclaración. Se puede agregar más solución de limpieza si se usa un espaciador más grande para obtener imágenes. Se puede utilizar una solución de montaje en lugar de la solución de limpieza cuando no se limpian los organoides. La solución de limpieza reduce el fondo al crear imágenes y aumenta la profundidad de la imagen. Coloque un espaciador adhesivo de 4 pocillos de doble cara de 0,05 mm en un portaobjetos de microscopio. Agregue los 10 μL de solución de limpieza con los organoides en un pocillo y coloque un cubreobjetos en la parte superior del espaciador.NOTA: Los organoides también se pueden montar sin el uso de un espaciador. El espaciador mantiene intacta la forma del organoide y evita que los organoides se aplanen. Mantenga la diapositiva en RT O/N para limpiar los organoides. Para un almacenamiento prolongado, mantenga los portaobjetos a 4 °C. Adquirir imágenes mediante un sistema de microscopía confocal.