用于转化疼痛研究的开源实时闭环电阈值跟踪

人体显微神经造影实验得到了布里斯托大学生命科学学院研究伦理委员会的批准（参考编号：51882）。所有研究参与者都给予了书面知情同意。动物实验是在布里斯托大学动物福利和伦理审查委员会批准后，根据1986年英国动物（科学程序）法案在布里斯托尔大学进行的，并受到项目许可证的保护。 1. 安装开放 Ephys GUI 和 APTrack 查看软件文档以查找支持的最新版本的 Open Ephys 图形用户界面 （GUI） （https://github.com/Microneurography/APTrack#readme），然后下载并安装 GUI。 从以下 URL 安装兼容版本的 GUI：https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases。 从 GitHub 下载最新版本：https://github.com/Microneurography/APTrack/releases。对于 Windows 计算机，将.dll文件复制到插件文件夹中，该文件夹通常位于 C：\Program Files\Open Ephys\plugins。对于 MacOS 计算机，请将 .bundle 文件复制到程序包的“内容/插件”文件夹中。 2. 记录和刺激装置的组装 使用制造商提供的电缆将采集板连接到计算机，然后打开电源。注意：对于人体显微神经造影，使用USB 3.0隔离器将参与者与计算机电隔离，采集板由便携式电池供电，而不是用于啮齿动物研究的电源电压电源。在人体研究期间，除步进电机控制板外，所有USB连接都通过USB隔离器。 将 I/O 板连接到采集板上的模拟输入端口。使用串行外设接口 （SPI） 电缆将 Intan RHD 录音主机连接到采集板。注意：这里使用的是 Intan 16 通道双极云台，但也可以使用其他单极 RHD2000 系列云台。 将PulsePal连接到计算机22。对于使用PulsePal的模拟电压控制刺激器（例如DS4）的组装，与鼠标挑逗光纤记录一样，请按照以下步骤2.5.1-2.5.3;对于使用步进电机的基于旋转编码器的刺激器（例如DS7）组装，与人体微神经造影记录一样，请执行以下步骤2.6.1-2.6.8（图1）。 如下所述，在GUI中构建信号链。将 Rhythm FPGA 插件插入信号链，方法是左键单击并将其拖动到信号链中;这将GUI连接到采集板。确保已单击ADC按钮以启动从I/O板记录ADC通道。ADC 按钮在打开时将呈橙色亮起。注意：如果您希望播放以前记录的实验数据，可以在开始时使用文件阅读器插件而不是Rhythm FPGA。将其与APTrack结合使用将允许对先前实验中的动作电位进行可视化和延迟跟踪。 在信号链中插入带通滤波器;300-6，000 Hz的默认设置适用于人类和鼠标记录。此外，在其后插入一个拆分器。 将 APTrack 插件插入分路器一侧的信号链和另一侧的 LFP 查看器。LFP 查看器提供传统的类似示波器的电压迹线视图，在实验期间非常有用。 在插件后插入一个记录节点。在下拉菜单中，将数据保存格式从二进制更改为 Open Ephys。这样就完成了一个简单的信号链，运行良好（图 2）;但是，可以根据实验要求添加其他组件。注意： 如果记录节点放置在信号链中的插件之前，则不会保存动作电位跟踪信息。 在GUI的右上角，单击播放按钮开始从采集板传输数据并将其可视化。要开始录制，请单击播放按钮旁边的圆形录制按钮。注意：很容易忘记单击记录;我们从开始获取的那一刻起就记录数据，以防止这种情况发生。 对于使用模拟电压控制刺激器的组装，请按照以下步骤操作。打开恒流刺激器的电源，其刺激幅度由模拟电压输入控制。本例使用DS4（图1）。 PulsePal输出通道1用于模拟电压命令。使用 BNC T 型分配器分离此信号，然后将其连接到恒流激励器输入和 I/O 板，以便记录命令电压。 PulsePal输出通道2用于电刺激TTL事件标记。将其连接到 I/O 板，以便记录刺激 TTL 事件标记，供插件使用和事后分析。 对于使用模拟电压控制刺激器的组装，请按照以下步骤操作。打开恒流刺激器的电源，其刺激幅度由旋转编码拨盘控制。本例使用DS7（图1）。 使用制造商提供的电缆和磁性支架将步进电机控制板连接到步进电机。 使用任何标准 USB A 到 USB 微型 B 电缆将控制板直接连接到计算机。请勿连接 USB 隔离器参与者侧的控制板，因为它也连接到 12 V 主电源。 如果是第一次使用控制板，将步进电机脚本从 GitHub 上传到控制板;这只需要执行一次，或者如果发布了步进电机脚本的任何软件更新。 将恒流刺激器上的刺激幅度拨盘设置为 0 mA。使用定制的安装支架连接步进电机和刺激振幅拨盘。这些可以3D打印，从而实现廉价，快速和可定制的安装解决方案。请查阅 GitHub 以查看是否已为所选刺激器设计了支架。 使用定制的桶适配器将步进电机桶连接到刺激幅度控制拨盘。出于强度和耐用性的原因，这些适配器应由金属制成;然而，3D打印部件也是合适的，尽管它们可能需要定期更换。请查阅 GitHub 以查看是否已经为所选刺激器设计了桶形适配器。 使用自定义安装和桶形适配器将控制板/步进电机设备松散地连接到刺激器控制旋钮上。注意：启动软件后，安装和桶适配器将稍后拧紧，步进电机自动设置为位置零。 按照协议步骤2.5.2-2.5.3（减去将输出通道1连接到刺激器）中所述连接PulsePal，因为仍然需要生成TTL事件标记才能进行分析和插件运行。此外，将输出通道2连接到DS7激励器以触发它。 如下所述准备小鼠皮肤神经制剂。随意向2-4个月大和两性的C57BL / 6J小鼠（英国查尔斯河实验室）提供食物和水。 通过腹膜内注射戊巴比妥钠（≥200mg / kg）通过麻醉剂过量剔除并确认循环停止后，使用Zimmermann等人描述的方法从小鼠后爪的背侧解剖皮肤和支配该区域的隐神经23。 在定制的双室丙烯酸浴（15 mL / min灌注速率，30 mL体积）的一半中将碳化合成组织液（表1）中的皮肤 – 神经制剂保持在30-32°C。将神经穿过一个小孔进入充满矿物油的腔室，并用凡士林密封。该油提供绝缘的记录环境。 使用超细镊子从神经躯干上梳理出两根细丝，并在双极银/氯化银记录电极的每一侧悬挂一根。 使用 RHD2216 16 通道双极头级对神经信号进行数字化和放大，并使用采集板对其进行处理。使用300-6，000 Hz的带通滤波器对30 kHz的信号进行采样，并使用GUI对其进行可视化。 使用钝玻璃棒，抚摸制剂的皮肤。使用低振幅质量数活动来确认制剂是否有效。 如下所述进行人 C 纤维显微神经造影。与提供书面知情同意书的参与者进行显微神经造影，如前所述24. 参与者舒适地坐在床上并用枕头支撑，使用超声扫描仪识别腓浅神经，并在胫骨中部附近标记外踝近端约 5-10 厘米的目标区域。 使用2%氯己定在70%酒精擦拭布中对目标区域周围的皮肤进行消毒，并在胫骨中部水平的预期记录部位附近皮下插入无菌参比电极。 在目标区域内的超声引导下将无菌记录电极插入腓浅神经。 使用 RHD2216 16 通道双极头级对神经信号进行数字化和放大，并使用采集板对其进行处理。使用300-6，000 Hz的带通滤波器对30 kHz的信号进行采样，并使用GUI对其进行可视化。注意：采集设备通过具有 5 kV RMS 隔离的 USB 3.0 隔离器与笔记本电脑电气隔离，并通过定制的 12 V 电池电源 供电 。 通过轻轻抚摸皮肤以揭示机械诱发的大规模活动来确认成功的神经内定位。此外，参与者通常在成功进行神经内定位后报告足背外侧感觉异常。 3. 外周神经元的软件设置和识别及表型 按如下所述设置软件。打开图形用户界面（图3）。如果步进电机控制板连接到您的PC，则会检测到它并将其自身设置为零位置。拧紧步骤 2.6.5-2.6.7 中所述的定制支架和桶形适配器，因为刺激器的刺激振幅拨盘和步进电机均设置为零。注意： 如果步进电机和刺激振幅拨盘未同时“归零”，则可能导致步进电机试图将控制拨盘调出其范围，从而可能导致损坏。 在选项菜单中，选择 触发通道。从 PulsePal 输出通道 2 中选择包含电刺激 TTL 标记的 ADC 通道 。 在选项菜单中，选择数据通道，然后选择包含电生理数据的 通道。 在刺激控制面板中，使用滑块定义初始、最小和最大刺激幅度。确保电流刺激设置为高于 0，以便生成 TTL 标记。注意：某些刺激器的输入输出缩放比不是 1：1;在选择合适的刺激幅度时，请考虑这一点。例如，在某些刺激系统上可以选择1：10的输出比，以实现恒流刺激器的更高输出。 在刺激控制面板中，单击 F 以加载包含刺激指令的文件。电刺激协议存储为逗号分隔值（CSV）文件，该文件由所需的刺激频率和持续时间组成，允许用户为其实验创建复杂的刺激范式。此处提供了一个示例模板：https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv 在刺激控制面板中，单击>以开始加载的刺激范例。默认情况下，APTrack 请求 PulsePal 生成持续时间为 0.5 毫秒的不同振幅的正方波脉冲，以控制恒流刺激器的刺激幅度。 时态栅格图将根据对电刺激的响应开始更新，每个新的刺激响应都将在右侧显示为一个新列。 可视化和识别单神经元动作电位。为了成功检测单神经元动作电位，设置合适的图像阈值非常重要。在时态栅格绘图面板中，调整低、检测和高影像阈值。在选项菜单中选择配色方案。在WHOT（白热）模式（默认）下，低于低图像阈值的电压以黑色编码。低图像阈值和检测阈值之间的电压以灰度编码。高于检测阈值的电压以绿色编码，高于高图像阈值的电压以红色编码。 外周神经元在低刺激频率（<0.25 Hz）下表现出恒定的潜伏期反应，这些反应由它们的传导速度和刺激和记录位点之间的距离决定。设置合适的图像阈值后，算法检测到的阈值交叉事件将以绿色编码（图 4）。 系统地在被记录的神经支配的皮肤区域周围移动刺激电极，允许每个部位至少发生三次刺激事件。监视时间栅格图，以了解在每个电刺激事件后同一时间点发生的阈值交叉事件（标记为绿色）。注意：在小鼠中，使用5mA的搜索刺激。在人类中，经皮电搜索刺激的振幅被滴定为言语疼痛等级，使其从未超过7/10。 检查在相同潜伏期和相同刺激位置连续出现的三个阈值交叉事件（绿色条）;这表明周围神经元动作电位的识别。 通过识别目标神经元感受野中最敏感的点来优化刺激电极位置，然后将电极固定到位。在人体显微神经造影的这一点上，切换到使用皮内电针针（直径0.2毫米）进行双极电刺激，在小鼠中，使用定制的经皮刺激探针，以使刺激位置恒定。 对周围神经元进行分类和感觉表型分析。通过手动调整模拟幅度或使用APTrack（如果需要）来估计目标动作电位的电阈值（如步骤4.1-4.2中所述）。 在整个感觉表型方案中，以 0.25 Hz 的频率以估计电阈值的 2 倍刺激感受野。 通过将传导距离除以传导潜伏期来计算神经元的传导速度。C-光纤可以通过≤2 m/s的传导速度来识别。 使用冯弗雷细丝机械刺激感受野，以确定激活的机械阈值。机械感觉可以通过电压迹线上可见的诱发动作电位和神经元潜伏期的增加来识别，如果它是 C 纤维，则在足够的力下。 加热神经元的感受野，再次观察电压迹线上可见的动作电位，以及在充分施加热量时神经元（如果是 C 纤维）的潜伏期增加。由于对轴突传播的热力学效应，热不敏感的神经元将表现出潜伏期的降低。注意：在人体显微神经造影中，请使用TSC-II进行快速准确的热控制。在小鼠制备中，将加热或冷却的合成组织液添加到放置在感受野上的铝隔离室中，以允许进入神经元末端，同时限制快速散热到周围流体中。使用热电偶记录温度。 冷却感受野，再次观察电压迹线上可见的动作电位，以及神经元潜伏期的显着增加，如果是C光纤，在足够的冷施用下。由于对轴突传播的热力学效应，所有神经元都会表现出潜伏期增加，因此在仅根据潜伏期增加将神经元标记为冷敏感时要小心。 4. 延迟和电阈值跟踪 执行延迟跟踪，如下所述。在识别时态栅格图上的单神经元动作电位后，移动时态栅格图右侧的灰色线性滑块以调整搜索框的位置。 在时态栅格图下方，将搜索框宽度旋转滑块调整为适当的宽度。使搜索框宽度变窄，以减少瞬态噪声尖峰、自发触发动作电位或其他附近的恒定延迟动作电位被错误识别为感兴趣的动作电位的机会。 要开始跟踪目标动作电位，请单击多单元跟踪表下方的 +。表中将添加一个新行，其中包含目标动作电位的详细信息，包括潜伏位置、在 2-10 个刺激上发射的百分比（在选项菜单中调整）以及检测到的峰值幅度。 一旦将动作电位添加到多单元跟踪表中，延迟跟踪算法（图5）将在每次后续电刺激时自动执行。 如果时态栅格图上有多个离散动作电位可见，请如上所述将它们添加到多单元追踪表中。可以添加到表中以进行同时延迟跟踪的理论最大动作电位数是最大 32 位整数值。 选中多单元跟踪表中的跟踪峰值框，将搜索框移动到该特定动作潜力的适当位置，具体取决于延迟 跟踪 算法。这将允许实时监控延迟跟踪，并确保跟踪按预期遵循动作电位。其他峰值的延迟跟踪将在后台照常进行。 使用每行末尾的删除按钮从多单元跟踪表中删除跟踪的动作电位。 执行电气阈值跟踪，如下所述。在0.1 V和0.5 V之间调整刺激控制面板中的增量和递减率。 保持这些值相等，除非这是实验范式的一部分，否则不要在实验过程中调整它们。 确保将刺激频率设置为适当的速率，通常为0.25-0.5 Hz，除非刺激频率的调制是实验范式的一部分。增加伤害感受器放电率可能会改变伤害感受器的电阈值。 成功跟踪动作电位后，选中多单元跟踪表中的跟踪阈值框，这将启动电 阈值跟踪 算法（图 6）。注意：电阈值跟踪仅在目标动作电位上运行;事实上，多单元跟踪表中其他动作电位的发射速率将随着刺激幅度的变化而相应更新。 手动将刺激幅度调整到电阈值的估计值;这将减少确定电阈值的等待时间。建立可靠的电阈值所需的时间取决于刺激频率、递增和递减率以及从初始刺激到神经元电阈值的刺激幅度差异。 该软件使用上下方法来估计神经元的电阈值。在多单元跟踪表中，发射速率是在之前的2-10次刺激（在选项菜单中选择）上确定的。选择要考虑的刺激事件数;较高的数字将提高阈值估计的可靠性，但需要更长的时间才能实现。 在人体显微神经造影过程中，监测电刺激的疼痛以防止参与者过度不适很重要;在研究伤害感受器，特别是沉默/睡眠的C纤维时，一些不适是不可避免的。在电阈值跟踪期间，当刺激幅度增加时，定期询问疼痛等级，并保持在恒流刺激器附近，以根据参与者的要求将其脱离。注意：或者，可以通过用户界面单击刺激控制面板中的 [ ] 按钮来脱离电刺激。 50%的点火率表示近似的电阈值已经确定。 在电阈值跟踪时，对感受野进行实验操作，例如温度或药物操作。将跟踪这些操作对伤害感受器的电阈值的影响。注意：在实验操作后，留出足够的时间来识别新的伤害感受器阈值。