Contrôle mécanique de la relaxation à l’aide de trabécules cardiaques intactes

Le protocole suivant a été approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la Wayne State University. Le protocole décrit ici les étapes d’utilisation de sujets expérimentaux sur des rongeurs, mais peut être adapté pour être utilisé dans d’autres organismes modèles. 1. Préparation Obtenez le sujet expérimental et laissez-le s’acclimater au laboratoire. Préparer 250 mL de solution de perfusion et 250 mL de solution modifiée de Tyrode (tableau 1), en oxygénant chacun à 10-20 ppm d’O2, avec un pH de 7,3. Préparez une seringue de 5 mL avec une canule attachée. Remplissez la seringue avec une solution de perfusion. Utilisez des canules de 23 G pour une souris et de 18 ou 16 G pour un petit ou un grand rat, respectivement. Faites glisser un tube en polyéthylène (PE) d’une longueur de 1 mm à l’extrémité d’une aiguille émoussée (Table des matériaux) pour éviter que l’aorte ne glisse de la canule après avoir été attachée. Préparation complète de la zone de dissection et de canulation (Figure 1)Remplissez deux bateaux de pesage propres au moins à mi-chemin avec une solution de perfusion. Immerger l’extrémité de la canule dans une solution de perfusion avec au moins une suture à double boucle placée autour de la canule. Tenez la seringue en place à l’aide d’une pince à barres. Placez des ciseaux chirurgicaux, un hémostatique, une pince à iris, une paire de petits ciseaux incurvés et deux pinces #3 pour un accès facile. Préparer le système expérimental (Figure 2) en amorçant et en faisant circuler la solution de Tyrode modifiée dans tout le système expérimental. Assurez-vous que la chambre est complètement pleine et stable. Activez tous les boîtiers d’acquisition de données, y compris le capteur de force, le moteur de longueur, le système de stimulation, le système de contrôle de la température et l’ordinateur d’acquisition de données. Copiez et renommez un dossier de modèle contenant les fichiers *.dap et pointeur requis pour référencer l’expérience en cours. Ouvrez le logiciel d’acquisition de données. Préparer les outils d’isolation trabecula (ciseaux Vannas, pinces #5 ou #55, sonde en verre) en immergeant leurs pointes dans de l’albumine sérique bovine (BSA) à 10% (p/v) dans de l’eau ultrapure ou une solution de perfusion, pour enduire le métal de protéines (Figure 2B).REMARQUE : L’ensemble du système expérimental doit être préparé avant la dissection. 2. Dissection grossière et canulation Consigner l’identification, le poids corporel et d’autres renseignements pertinents sur l’animal concerné. Éventuellement, injecter 1 000 U/kg d’héparine dans une solution saline stérile au rongeur par injection intrapéritonéale au moins 10 minutes avant l’euthanasie, afin de minimiser les risques de coagulation avant la perfusion coronaire. Placez l’animal dans une chambre d’induction et induisez une anesthésie générale en utilisant 3% à 5% d’isoflurane vaporisé dans 100% d’oxygène, selon la procédure standard.REMARQUE : Allumez les épurateurs externes, les tables à tirage vers le bas ou les hottes utilisées pour minimiser l’exposition à l’isoflurane. Une fois que le rongeur perd son réflexe de redressement et que le rythme respiratoire a ralenti:(Pour un rat) retirer l’animal de la chambre d’induction et le placer couché sur le dos sur un tampon de dissection, avec une anesthésie continue à travers un cône nasal. (Pour une souris) effectuer une luxation cervicale immédiatement après avoir retiré l’animal de la chambre d’induction. Le cône de nez n’est pas nécessaire. Tournez le vaporisateur d’isoflurane à 0%. Si nécessaire, fixez les membres supérieurs du rongeur au tampon de dissection loin de la paroi thoracique à l’aide de ruban adhésif soutenu par des épingles, en prenant soin de ne pas percer l’animal. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie appropriée (absence de réponse de pincement des orteils) avant de procéder à la dissection. À l’aide de ciseaux chirurgicaux (Mayo pour les rats, Metzenbaum pour les souris), juste en dessous du processus xyphoïde, coupez la peau transversalement sur toute la largeur de l’abdomen du rongeur dans l’espace péritonéal. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites deux coupes verticales parasagittales (sur les côtés de la paroi thoracique) sur les côtés gauche et droit de la paroi thoracique à partir de la coupe transversale. Ensuite, coupez à travers le diaphragme, reliant les coupes parasagittales et libérant l’espace thoracique. Serrez et soulevez le processus xyphoïde à l’aide d’un hémostatique vers la tête du rongeur, pour déplacer le sternum et la paroi thoracique vers la tête du rongeur, exposant l’espace thoracique et le cœur. Si nécessaire, étendez rapidement les coupures parasagittales près du deuxième espace vertébral, pour exposer complètement le cœur et / ou briser la membrane péricardique. À l’aide d’une pince à iris incurvée, soulevez soigneusement le cœur pour visualiser les grands vaisseaux. Placez la pince entre le myocarde et la colonne vertébrale du rongeur, serrez les vaisseaux supérieurs et soulevez le cœur, en prenant soin de ne pas serrer les oreillettes ou les segments ventriculaires.Tout en soulevant légèrement le cœur, placez rapidement les ciseaux d’iris incurvés (concave vers le haut) entre la pince incurvée de l’iris et la colonne vertébrale du rongeur, et coupez les grands vaisseaux et les poumons loin du cœur. Déplacez rapidement le cœur dans un bateau de pesée ou un bécher contenant une solution de perfusion fraîche et secouez pour aider à éliminer le sang du cœur. Tournez le vaporisateur d’isoflurane à 0%, si ce n’est déjà fait. Si de grands segments de poumon, de tissu péricardique ou d’autres tissus restent attachés au cœur, coupez-les soigneusement et jetez-les à ce moment-là pour minimiser les interférences avec la canulation. À l’aide de la pince à iris incurvée, déplacez le cœur dans un bateau de pesée ou un bécher propre, avec la canule préparée immergée. Canuler l’aorte, fixer l’aorte en serrant la suture de soie bouclée et rincer avec jusqu’à 5 ml de solution de perfusion. Retirez le cœur de la canule et placez-le dans un plat de pesée recouvert d’élastomère de silicone pour préparer l’isolement de la trabécula. 3. Isolement et équilibrage de trabecula Placez le cœur dans la capsule recouverte d’élastomère de silicone sous un stéréomicroscope et éclairez-le. Localisez le couloir d’écoulement ventriculaire droit. Épinglez l’oreillette gauche et l’apex ventriculaire à l’élastomère de silicone dans le plat. À l’aide de longs ciseaux Vannas, couper du tractus d’écoulement ventriculaire droit à l’apex le long du septum. Couper de la voie d’écoulement ventriculaire droite à l’oreillette droite près de l’aorte, puis couper à travers l’oreillette droite (figure 3B). À l’aide d’une pince, ouvrez soigneusement la paroi libre du ventriculaire droit (RV) du tractus de sortie, en prenant soin de ne pas étirer le tissu.REMARQUE: Les expérimentateurs peuvent trouver de minces brins de tissu conjonctif blanc, qui peuvent être coupés sans souci. Les brins plus grands, de couleur rose (tissu) doivent être évalués avec soin, car il peut s’agir de trabécules qui peuvent être isolées. Épinglez la paroi libre du triangle du ventricule droit à la capsule pour exposer le ventricule droit (Figure 3C). À l’aide d’une pipette en verre fondue et formée avec une extrémité mince (<500 μm de diamètre) mais pas tranchante, rechercher dans l’endocarde exposé des trabécules autoportantes (figure 3C).REMARQUE: Une trabecula autonome est une bande de muscle que l’on peut complètement sonder dessous. Utilisez des trabécules qui ont des côtés parallèles (largeur constante), en évitant les muscles papillaires triangulaires. Soyez prudent pendant ce processus et la dissection ultérieure, car l’application d’une contrainte sur la trabecula peut causer des dommages, réduisant ainsi la force développée. Disséquez la trabecula à l’aide de petits ciseaux Vannas. Laissez un morceau de tissu cube de ≥1 mm à chaque extrémité du trabecula pour permettre la fixation. N’étirez pas la trabecula dans la mesure du possible et minimisez le contact des outils métalliques, car les deux peuvent également endommager le muscle. Déplacez les broches qui maintiennent le cœur au besoin pour minimiser la tension sur le muscle près des trabécules identifiées. Couper ~ 2 pouces de l’extrémité d’une pipette de transfert de 7 mL, aspirer lentement la trabecula dans la pipette et la transférer dans un nouveau plat de pesée contenant 50% de solution de perfusion et 50% de solution de Tyrode modifiée. Laissez le muscle s’équilibrer à l’augmentation du calcium extracellulaire dans la solution mélangée pendant plusieurs minutes.Répétez les étapes 3.7 à 3.8 pour disséquer des trabecula supplémentaires à ce stade, afin d’obtenir des trabecula supplémentaires en tant que sauvegarde. Éteignez la pompe fournissant la surfusion et/ou l’aspiration à la chambre expérimentale. À l’aide de la pipette de transfert de grand alésage, déplacez la trabecula dans la chambre expérimentale remplie de la solution de Tyrode. Épinglez un morceau de tissu cube de >1 mm à l’extrémité de la trabecula à un crochet du capteur de force, puis épinglez le deuxième cube au moteur.REMARQUE: Séparez le moteur et le capteur de force lors du montage du premier côté pour un meilleur accès au transducteur, puis déplacez les crochets aussi près que possible lorsque vous montez le deuxième cube de tissu pendant que la trabecula reste relâchée. Redémarrez la superfusion et commencez à rythmer le muscle pour déterminer la tension de seuil. Marcher à 20% au-dessus de la tension seuil pendant environ 1 h pour permettre à la trabecula de s’équilibrer. À la fin de cette période d’équilibre, étirez lentement le muscle à l’aide du micromètre connecté au moteur jusqu’à ce que la génération de stress développée optimale soit atteinte, en observant la tension développée (minimale à maximale). Arrêtez d’augmenter la longueur musculaire lorsque la tension diastolique passive augmente plus rapidement que la tension maximale, indiquant que la longueur optimale a été dépassée. Éteignez l’éclairage transmis du microscope et illuminez le trabecula à l’aide d’un illuminateur à col de cygne à un angle raide. À l’aide d’une caméra connectée via l’optique du microscope qui a déjà été calibrée, capturez une image de la trabecula pendant la diastole dans le dossier expérimental. Si le trabecula est plus large que le champ de vision de la caméra, prenez plusieurs images à travers le muscle. Ouvrez la ou les images dans un logiciel d’imagerie qui signale les distances en pixels.Mesurez la distance en pixels du diamètre du muscle quatre fois sur sa longueur. Mesurez la longueur du muscle (trabécule) en pixels, à l’exclusion du grand cube de tissu. Si la longueur du muscle est plus longue que le champ de vision, utilisez des points de référence le long du muscle pour mesurer toute la longueur. À l’aide du modèle du dossier expérimental, faites la moyenne des mesures de diamètre et convertissez le diamètre et les longueurs de pixels en mm à l’aide d’un étalonnage obtenu précédemment. Calculez la section transversale comme π*diamètre 2/4 en mm2, et la longueur du muscle en μm. 4. Acquisition de données Une fois le muscle équilibragé, ouvrez le logiciel d’acquisition de données, sélectionnez Expériences | Contrôle de la longueur, puis entrez la longueur trabecula étalonnée (FL) et la section transversale (zone [m2]) dans la case Étalonnage. Dans le dossier du modèle (étape 1.7), assurez-vous que le freeform_file.txt pointe vers le dossier approprié et ouvrez le fichier freeform.dap dans un éditeur de texte. Définissez le niveau isotonique (isoton) sur 32 000 dans le fichier *.dap. Dans la zone Contrôle de longueur, sélectionnez l’onglet Forme libre et accédez au fichier de liste Freeform approprié. Assurez-vous que le chemin d’archivage des données est également le dossier approprié pour enregistrer les données. Commencez à acquérir des données à partir de secousses entièrement isométriques en appuyant sur Run Experiment, avant d’acquérir des données de pince de charge à l’aide d’un contrôle de rétroaction avec des paramètres de gain proportionnels et d’intégration. Acquérir des données de compression de charge en définissant la postcharge (isoton) dans le fichier *.dap et itérez les valeurs de gain proportionnel (propgain) et d’intégration (Ki) en enregistrant le fichier dans l’éditeur de texte. Appuyez sur Run Experiment dans l’interface du logiciel d’acquisition de données.Assurez-vous que la pince comprend un rallongement à sa longueur initiale (parfois appelée charge de relaxation 5) au cours de cette itération pour atteindre la plage maximale de vitesses de déformation, en réglant le mode (flswitch) de un et en augmentant le seuil de fin de la pince de charge (flthreshold) à partirde zéro. Contrôlez l’extrémité de la pince de charge en changeant le mode (flswitch) de un à zéro. Répétez l’acquisition tout en changeant l’extrémité de la pince de charge de l’allongement zéro à l’allongement complet à la longueur de départ.Pour augmenter la longueur, augmentez progressivement le seuil de fin de la pince de charge (flthreshold) de zéro jusqu’à ce que le muscle revienne presque à sa longueur initiale. Réinitialisez le mode (flswitch = 1) et le seuil (flthreshold = 0), puis exécutez une dernière acquisition de données. Si vous le souhaitez, modifiez la postcharge dans l’étude en répétant les étapes 4.4-4.6. Cette acquisition peut se faire immédiatement. Si vous le souhaitez, modifiez la précharge en étirant ou en raccourcissant le muscle, ou traitez le muscle en ajoutant des composés à la solution de Tyrode. Si vous modifiez la précharge ou ajoutez des composés, attendez au moins 20 minutes pour vous assurer que la réponse de force lente 9,15 s’est stabilisée et/ou que le composé pénètre complètement dans le muscle. Une fois l’acquisition de données terminée, retirez la trabécule. Si nécessaire, congelez ou fixez le trabecula pour analyse biochimique ou histologique. Nettoyez les zones de travail et le système expérimental, rincez tous les tubes avec de l’eau et éteignez tous les composants. 5. Analyse des données Ouvrez les fichiers de données à l’aide d’un programme d’analyse quantitative en dirigeant le programme vers le chemin de fichier approprié. Quantifier la relaxation en s’assurant que le programme d’analyse des données analyse le battement serré et que le programme acquiert correctement le début de la pince de charge.S’assurer que l’extrémité de la pince de charge est identifiée, de sorte que le taux de relaxation (1/τ) soit quantifié à partir de la dérivée négative de crête de la contrainte lors d’une relaxation isométrique. Utiliser la méthode de Glantz16 pour déterminer cette constante de temps exponentielle, ou une autre quantification appropriée de la relaxation (dérivée minimale de contrainte, constante de temps logistique 17 ou modèle cinématique18). Assurez-vous que le programme d’analyse des données calcule le taux de déformation en prenant la dérivée temporelle de la déformation, où la déformation est calculée comme la longueur en fonction du temps divisé par la longueur à la contraction optimale. Répétez les étapes ci-dessus pour toutes les traces d’une condition donnée. Tracer la relation entre le taux de relaxation et le taux de déformation, en limitant les données maximales à un taux de déformation physiologique inférieur à 1 s-1. Exclure les données à faibles taux de déformation (figure 4C), car la phase de relaxation peut ne pas refléter la décroissance exponentielle17,18. Obtenez la pente de la ligne entre le taux de relaxation et la vitesse de déformation, et notez la pente comme indice de MCR. Répétez l’analyse ci-dessus pour chaque condition interrogée.