Eine 3D-Kultivierungsmethode von Sphäroiden embryonaler und Leberzebrafischzelllinien
Summary
Hier stellen wir ein effektives, einfaches und schnelles 3D-Kulturprotokoll für die Bildung von Sphäroiden von zwei Zebrafisch-Zelllinien (Danio rerio) vor: ZEM2S (Embryo) und ZFL (normaler Hepatozyten).
Abstract
Fischzelllinien sind vielversprechende In-vitro-Modelle für die Ökotoxizitätsbewertung; Herkömmliche Monolayer-Kultursysteme (2D-Kulturen) haben jedoch bekannte Einschränkungen (z. B. die Langlebigkeit der Kultur und die Aufrechterhaltung einiger in vivo zellulärer Funktionen). Daher wurden 3D-Kulturen, wie z. B. Sphäroide, vorgeschlagen, da diese Modelle gewebeähnliche Strukturen reproduzieren und die In-vivo-Bedingungen besser erfassen können. Dieser Artikel beschreibt ein effektives, einfaches und schnelles 3D-Kulturprotokoll für die Bildung von Sphäroiden mit zwei Zebrafisch-Zelllinien (Danio rerio): ZEM2S (Embryo) und ZFL (normaler Hepatozyten). Das Protokoll besteht darin, die Zellen in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und extrem niedriger Befestigung zu plattieren. Nach 5 Tagen unter orbitalem Schütteln (70 U/min) bildet sich ein einzelnes Sphäroid pro Well. Die gebildeten Sphäroide weisen eine stabile Größe und Form auf, und diese Methode vermeidet die Bildung mehrerer Sphäroide in einer Vertiefung. Daher ist es nicht notwendig, Sphäroide ähnlicher Größe von Hand auszuwählen. Die Einfachheit, Geschwindigkeit und Reproduzierbarkeit dieser Sphäroidmethode machen sie für In-vitro-Tests mit hohem Durchsatz nützlich.
Introduction
Sphäroide sind kleine Zellkügelchen, die entstehen, wenn Zellen in engem Zell-zu-Zell-Kontakt in 3D-Kultur kultiviert werden. Die Fähigkeit von Sphäroiden, die in vivo Gewebeumgebung nachzuahmen, wurde bereits in einer Vielzahl von Zelllinien und Primärzellen untersucht 1,2. Obwohl Sphäroide für Toxizitätsstudien an Säugetieren gut entwickelt sind, ist die Entwicklung von Sphäroiden für Toxizitätsstudien mit Nicht-Säugetieren (z. B. Fischen) noch im Gange3. Für Fischzelllinien wurden Sphäroide durch eine Vielzahl verschiedener Methoden entwickelt, wie z. B. orbitales Schütteln (OS) unter Verwendung verschiedener Arten von Well-Platten 3,4,5,6,7 und die Methode der Magnetschwebetechnik unter Verwendung magnetischer Nanopartikel 8. Einige dieser Kulturmethoden für Sphäroide können jedoch mehr Nachteile haben als andere.
Beispielsweise können Kreiselmethoden in großen Mikrotiterplatten (24-Well-Platten) eine große Anzahl von Sphäroiden erzeugen, die sich in Größe und Form unterscheiden. In der Tat wurde die Bildung von Multi-Sphäroid-Strukturen nachgewiesen7. Dies erfordert intensive Bemühungen, Sphäroide mit ähnlicher Größe und Form für ein Experiment auszuwählen. Die 3D-Hängetropfen-Kulturmethode wird üblicherweise zur Erzeugung von Sphäroiden der Säugetierzelllinien 1,2,9,10,11 verwendet, wobei einzelne Sphäroide pro Tropfen erzeugt werden können, wodurch die oben beschriebenen Probleme vermieden werden. Eine modifizierte Hanging-Drop-Methode (Hanging Drop + Orbital Shaking) ist zwar in der Lage, mit einem kostengünstigen Verfahren ZFL-Sphäroide zu erzeugen, hat aber ihre Nachteile12. Die gebildeten zellulären Aggregate können in den Tropfen nicht über längere Zeiträume aufrechterhalten werden; Daher müssen sie auf Well-Platten übertragen werden. Dieser Prozess erfordert eine intensive Handhabung und lange Arbeitszeiten in einer Laminar-Flow-Haube, da er unter Verwendung einer Mikropipette12 tropfenweise durchgeführt wird. Darüber hinaus benötigt diese Methode 10 Tage, um die ZFL-Sphäroide vollständig zu bilden (5 Tage im hängenden Tropfen + 5 Tage im Betriebssystem)12. Diese Nachteile können die Anwendung von 3D-Fischsphäroiden für Toxizitätstests einschränken, insbesondere im Hinblick auf potenzielle Anwendungen für die Priorisierung von Chemikalien und die Nachhaltigkeit von Produkten.
Daher beschreibt dieser Artikel ein 3D-Kulturprotokoll, das in der Lage ist, einzelne Sphäroide von ZFL (D. rerio normal hepatozyten) und ZEM2S (D. rerio blastula phase embryo) Zelllinien zu erzeugen, basierend auf der kombinierten Verwendung von 96-Well-Ultra-Low-Attachment-Platten (ULA-Platten) und einem Orbitalschüttler (22 mm Rotationsdurchmesser). Die angewandte Methode ist einfach und reproduzierbar und kann in kurzer Zeit (5 Tage) eine große Anzahl von Sphäroiden ähnlicher Größe und Form erzeugen. Die Vorteile dieser Methode können die Anwendung von Fisch-3D-Modellen für aquatische Toxizitätsstudien sowohl in der Industrie als auch in der Wissenschaft sowie den Fortschritt bei der Implementierung alternativer Methoden für Ökotoxizitätstests unterstützen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dies ist eine einfache, leichte und schnelle Methode zur Erzeugung von Sphäroiden aus Leber- und Embryozelllinien von Zebrafischen. Diese Methode wurde von dieser Gruppe auf der Grundlage von Modifikationen bestehender 3D-Sphäroidmethoden entwickelt, um Probleme zu überwinden, die in wissenschaftlichen Studien im Zusammenhang mit der Sphäroidbildung berichtet wurden, sowie Unsicherheiten in der Datengenauigkeit von 3D-Sphäroid-Assays. Die berichteten Probleme liegen beispielsweise in Schwierigkeiten bei der Handhabu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
In Gedenken an Dr. Márcio Lorencini, einen Mitautor dieser Arbeit, einen exzellenten Forscher auf dem Gebiet der Kosmetik, der sich der Förderung der kosmetischen Forschung in Brasilien verschrieben hat. Die Autoren danken dem Multi-User-Labor in der Abteilung für Physiologie (UFPR) für die Verfügbarkeit von Geräten und für die finanzielle Unterstützung der Koordination zur Verbesserung des Hochschulpersonals (CAPES, Brasilien) (Finance Code 001) und der Grupo Boticário.
Materials
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
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