Primer Rhesus Macaque B Hücrelerinin Gen Düzenlemesi

Tüm hayvan prosedürleri ve deneyleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü’nün Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirilmiştir. Aşağıdaki protokollerin bir özeti Şekil 1’de sunulmuştur. 2-8 yaşları arasındaki Hint genetik kökenli erkek ve dişi rhesus makakları (Macaca mulatta), biyogüvenlik seviye 2 tesisinde Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Komitesi’nin yönergelerine uygun olarak barındırıldı ve bakımı yapıldı. DİKKAT: Tüm deneyler, kan yoluyla bulaşan patojenler için evrensel önlemlere uygun olarak, laminer akış davlumbazlarında steril / aseptik teknikler ve uygun biyogüvenlik seviye 2 ekipmanı ile gerçekleştirilmiştir. 1. rAAV6 üretimi Reaktifleri rAAV6 üretimi için hazırlayın.Standart teknikleri kullanarak pAAV vektöründeki AAV2’nin ters terminal tekrarları (ITR’ler) arasında homolojiye yönelik onarım şablonunu tasarlayın ve klonlayın. Homoloji kollarının her iki tarafta da en az ~ 250 bp olduğundan emin olun, ancak yapı tasarımı izin veriyorsa daha uzun homoloji kolları tercih edilmesine rağmen, 60 bp kadar az yeterli olabilir. Kullanılan sgRNA’lardan herhangi birinin hedef dizileri HDRT’de mevcutsa, hedef bölgenin protospacer bitişik motifinde veya tohum bölgesinde en etkili olan sessiz mutasyonları kullanarak bunları çıkarın.NOT: Verimli klonlama32 için Gibson tertibatı ile kombine gen sentezi gerçekleştirilebilir. Transfeksiyon için doğru bir klonun Maxiprep’ini hazırlayın. SgRNA tasarımı için CHOPCHOP33 önerilir ve https://zlab.bio/guide-design-resources daha fazla aletin bir listesi bulunabilir. ITR’ler dahil AAV için maksimum paketleme kapasitesi ~ 4,7 kb’dir. AAV6, hematopoetik hücreleri, özellikle B hücrelerini düzenlemek için en sık kullanılan serotiptir9. Rhesus makak B hücrelerinin gen düzenlemesi için diğer AAV serotipleri test edilmemiştir, ancak fare çalışmalarında AAV28 ve AAV-DJ10,11 kullanılmıştır. 293AAV kültür ortamını ve üretim ortamını Tablo 1 ve Tablo 2’ye göre hazırlayın. 0,2 μm polietersülfon (PES) membran filtre ünitesi ile steril filtre. 4 °C’de saklayın. 1x polietilenimin (PEI) çözeltisi hazırlayın (1 mg / mL, 100 mL). 250 mL’lik bir cam beherde, ~ 30 s boyunca bir mikrodalgada ~ 70 mLH2O ısıtın ve ardından 100 mg PEI ekleyin. Manyetik bir karıştırıcı ekleyin ve PEI çoğunlukla çözülene kadar karıştırın. 1 M HCl ile pH’ı 7’ye ayarlayın, ardındanH2O ile 100 mL’ye kadar doldurun, 10 dakika bekleyin, pH’ı tekrar kontrol edin ve gerekirse ayarlayın. PEI çözeltisini 0,2 μm PES membran filtre ünitesi, aliquot ile steril filtreleyin ve -20 °C depolayın. Çözüldükten sonra, çözelti 2 aya kadar 4 ° C’de saklanabilir. 5x polietilen glikol (PEG) / NaCl çözeltisi hazırlayın. 400 g PEG 8.000 ve 24 g NaCl ağırlığındadır. 2 L’lik bir cam behere manyetik bir karıştırıcı ekleyin, tartılmış PEG 8.000 ve NaCl’yi ekleyin ve ~ 550 mL deiyonize su ile durulayın. Isıtma ile karıştırın ve tamamen eriyene kadar kaynatın veya 80-90 ° C’ye getirin. 1 M NaOH ile pH’ı ~7,4’e ayarlayın, ardından bir ölçüm silindiri kullanarak ses seviyesini 1 L’ye ayarlayın ve manyetik karıştırıcı ile 2 L’lik bir cam şişeye aktarın. Şişeyi, manyetik karıştırıcıyı ve çözeltiyi 121 ° C’de 30 dakika boyunca bir su banyosunda otoklavlayın. Otoklavlamadan sonra, farklı fazlara ayrılmayı önlemek için manyetik karıştırıcıyı kullanarak karıştırırken çözeltiyi soğuk bir odada soğutun. Gerekirse Aliquot ve 4 ° C’de saklayın. Formülasyon tamponunu hazırlayın. 500 mL DPBS’yi 50 μL Pluronic F-68 ile karıştırın. 0,2 μm PES membran filtre ünitesi ile steril filtre uygulayın ve oda sıcaklığında (RT) saklayın. Hücre kültürü, transfeksiyon ve rAAV6 üretimi için transdüksiyonÇözme, kültür ve dondurma 293AAV hücreleri, yukarıdaki 293AAV kültür ortamını ve bölme için Tripsin-EDTA’yı kullanarak üretici tarafından tarif edildiği gibi. Bazı erken pasajların dondurulması ve hücrelerin 40. pasaja ulaşmadan önce AAV üretimi için kullanılması önerilir. rAAV6 üretimi için, her biri 30 mL’de 5 x 106 hücreli dört adet 15 cm’lik hücre kültürü kabı tohumlayın. Hücreler genellikle tohumlamadan 1-2 gün sonra% 80-90 birleşmeye ulaştıklarında transfeksiyona hazırdır. AAV6’ya paketlenmek üzere HDRT içeren bir pAAV plazmidinin Maxiprep’ini çözün. 85.6 μg pAAV plazmidini 3 mL saf DMEM ortamında yeniden askıya alın. 342 μL 1 mg/mL PEI çözeltisini 3 mL saf DMEM ortamında çözün. Her iki çözeltiyi de RT’de 10 dakika boyunca inkübe edin. Her iki 3 mL tüpü ~ 6.4 mL transfeksiyon karışımından oluşan bir tüpe karıştırın ve RT’de 20 dakika boyunca inkübe edin. Bu arada, tetrasiklin etkin, kendiliğinden susturulan yardımcı vektör RepCap6’yı 37 ° C’lik bir su banyosunda -80 ° C’lik dondurucudan çözün. 293AAV hücrelerini dönüştürmek için, medyan doku kültürü enfeksiyöz dozunu (TCID 50) kullanarak ve 1.15 x 107 hücre / çanak varsayarak 25’in çok sayıda enfeksiyonuna (MOI) yardımcı vektörü ekleyin; tipik olarak, 15 cm’lik çanak başına 2-10 μL kullanılır. Bulaşıkları dağıtmak için hafifçe sallayın ve döndürün. Transfeksiyon karışımının inkübasyonundan sonra, dört 15 cm’lik kabın her birine damla damla 1.6 mL ekleyin. Gece boyunca 37 °C ve %5 CO2’de inkübe edin.NOT: Alternatif olarak, ilgilenilen rAAV6 vektörleri zaten mevcutsa, bu vektörler paketlenecek viral genomu sağlamak için kullanılabilir, bu da bu sistemle herhangi bir plazmid ihtiyacını ortadan kaldırır ve karşılaştırılabilir rAAV6 titreleri verir. Bu yaklaşım için, 293AAV hücreleri, yardımcı vektörle birlikte 50’lik bir MOI’de (rAAV6 genom kopyalarına [GC] / mL’ye dayanarak) istenen rAAV6 ile birlikte dönüştürülür. Ertesi gün, kültür ortamını dikkatlice aspire edin ve atın ve 30 mL önceden ısıtılmış üretim ortamı ile değiştirin. Hasattan önce 96 saat daha kuluçkaya yatırın. Verimi en üst düzeye çıkarmak için başka bir ortam değişikliği önerilmez. Rekombinant AAV6’nın ortamdan toplanması ve saflaştırılmasıHücreleri çanaktan çıkarmadan, tüm hücre süpernatantını, filtrelenecek ortamın hacminden en az% 50 daha büyük 0.2 μm PES membranına sahip bir filtre ünitesinde toplayın. Ardından, süpernatanı filtreleyin.NOT: Daha yüksek rAAV6 verimi isteniyorsa, hücreler toplanabilir ve rAAV, ticari kitler veya belirlenmiş protokoller34,35 kullanılarak hücre peletinden çıkarılabilir. AAV6 çoğunlukla36 ortamına salgılandığından, sadece süpernatant kullanıldı ve işçilik, maliyet ve zaman azaltıldı. Toplanan hacmin% 25’inde filtrelenmiş süpernatanta 5x PEG / NaCl çözeltisi ekleyin; 30 mL’lik dört adet 15 cm’lik tabak kullanılıyorsa bu tipik olarak 30 mL’dir. Ters çevirerek iyice karıştırın ve daha sonra viral parçacıkları çökeltmek için gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin.NOT: AAV partikülleri bu çözeltide 2 güne kadar stabildir. 250 mL boru uçlu bir salıncak kovası santrifüjünü 4 °C’ye kadar önceden soğutun. RT’de en az 1 saat boyunca her bir membranı 2 mL% 10 Pluronic F-68 ile ön işlemden geçirerek 100 kDa kesim ve 0,22 μm hidrofilik PES şırınga filtresine sahip 4 mL’lik bir santrifüj filtre ünitesi hazırlayın. AAV-PEG / NaCl karışımını 250 mL’lik bir tüpe aktarın, 4 ° C’de 1 saat boyunca 2.500 x g’de santrifüj yapın ve ardından tüm süpernatantı aspirasyonla dikkatlice çıkarın. Tamamen yeniden askıya alınana kadar 4 mL 1 M HEPES’te vorteks yaparak bejden beyaz viral pelete yeniden askıya alın. Gerekirse, 5 dakika bekletin ve tekrar girdap yapın. 5 mL’lik bir serolojik pipet kullanarak yeniden askıya alın ve toplam hacmi 15 mL’lik bir tüpe aktarın. Bir duman davlumbazında, virüs süspansiyonuna eşit miktarda kloroform ekleyin – tipik olarak 4 mL. 2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde vorteks yapın ve daha sonra RT’de 5 dakika boyunca 1.000 x g’de santrifüj. Üst tabakayı (AAV içeren süpernatan) yeni bir 50 mL tüpte toplayın ve alt tabakayı (kloroform) atın.DİKKAT: Kloroform içeren çözeltiler tehlikeli atıklardır. İmhası için kurumsal yönergelere uyun. AAV içeren süpernatantı bir duman davlumbazının altına yerleştirin ve kalan kloroformun 30 dakika boyunca buharlaşmasına izin verin. Bu arada, önceden işlenmiş santrifüj filtre ünitesini ve şırınga filtresini yıkayın. Ön işlemden geçirilmiş santrifüj filtre ünitesine 1,5 mL formülasyon tamponu ekleyin. Sallanan kova rotorunda 15 °C’de 10 dakika boyunca 3.500 x g’de santrifüj. Membranı yıkamak için bu adımı 4 mL formülasyon tamponu ile tekrarlayın. Şırınga filtresini 5 mL’lik bir şırınga kullanarak 5 mL formülasyon tamponu ile iki kez durulayın. Kloroform ekstraksiyonundan ~ 4 mL AAV içeren süpernatantı 5 mL’lik bir şırıngaya yükleyin, yıkanmış şırınga filtresini takın ve doğrudan santrifüj filtre ünitesine filtreleyin. 15 °C’de 25 dakika boyunca 3.500 x g’de santrifüj yapın ve ardından filtredeki AAV çözeltisinin 50-100 μL arasında olduğunu doğrulayın. Çözeltinin hacmi >100 μL ise, santrifüj yapmaya devam edin. Filtreyi çıkardıktan sonra, santrifüjlü filtre ünitesinin kabının içine 4 mL formülasyon tamponu ekleyin ve çözeltiyi pipetleme ile eşit şekilde karıştırın. 15 °C’de 25 dakika boyunca 3.500 x g’de santrifüj yapın ve ardından filtredeki AAV çözeltisinin 50-100 μL arasında olduğunu onaylayın. Çözeltinin hacmi >100 μL ise, santrifüj yapmaya devam edin. Başka bir yıkama için bu adımı tekrarlayın. Son santrifüjlemeden sonra, çözeltinin hacminin 50-70 μL olduğunu onaylayın; değilse, santrifüj yapmaya devam edin. Preparatı 1,5 mL’lik bir tüpe aktarın. İstenirse Aliquot ve -80 ° C’de saklayın. qPCR ile rekombinant AAV6 titre tayiniNOT: qPCR primerleri ITR bölgesinde tavlanır ve bu nedenle pAAV’ye klonlanan tüm yapılar için uygun olmalıdır.Titre edilecek rAAV6’nın bir alikotunu ve AAV6 referans malzemesinin bir alikotunu çözün. AAV6 referans materyali 4 x 1011 GC/mL’ye yakın olmalıdır; Aksi takdirde, seyreltmeleri buna göre ayarlayın. Numunenin 2.0 μL’sini veya AAV6 referans materyalini 15.6 μL nükleaz içermeyenH2O, 2.0 μL 10x DNaz I tamponu ve 0.4 μL DNaz I tamponu ile birleştirerek rAAV6 preparatında kalan serbest plazmid DNA’sını çıkarmak için bir DNaz I sindirimi gerçekleştirin. Yavaşça karıştırın ve 37 ° C’de 30 dakika boyunca inkübe edin ve ardından buza aktarın. Bu seyreltme 1’dir (bkz. Tablo 3). Tüm numunelerin ve AAV6 referans materyalinin beş kat seri seyreltisini aşağıdaki Tablo 3’te olduğu gibi su ile hazırlayın. Bir SYBR Green qPCR master mix hazırlayın. Kuyu başına, 4,7 μL nükleaz içermeyen suyu, 10 μL SYBR Green ana karışımı, 100 μM’de 0,15 μL ITR astarı ileri ve 100 μM’de 0,15 μL ITR astarı ters yönde karıştırın.NOT: Her numune, referans standardı için 16 kuyucuk, numune başına 8 kuyucuk ve şablonsuz kontrol için 2 kuyucuk ile çift olarak ölçülür. Pipetleme hatasını hesaba katmak için daha fazla ana karışım hazırlayın. Optik 96 delikli veya 384 delikli bir reaksiyon plakasında, SYBR Green qPCR ana karışımının 15 μL/kuyusunu yükleyin. Ardından, şablonsuz kontrol için 5 μL numune ve AAV6 referans malzemesi veya nükleaz içermeyen su yükleyin. AAV6 referans standardı için, yük seyreltme 2 ila seyreltme 9. Numuneler için, seyreltme 5’i seyreltme 8’e kadar yükleyin. Her seyreltmeyi çift olarak ölçün. Kabarcıklardan kaçının. Yüklü plakayı optik şeffaf filmle kapatın, RT’de 1 dakika boyunca 800 x g’de santrifüj yapın ve plakayı uygun 96 delikli veya 384 delikli kurulumla qPCR cihazına yükleyin. Aşağıdaki çevrim koşullarında SYBR algılamasını kullanarak qPCR cihazını kurun ve çalıştırın: 3 dakika boyunca 98 °C, daha sonra 15 s için 98 °C’lik 40 döngü ve 30 sn için 58 °C, ardından bir erime eğrisi. Standart eğri olarak milimetre başına genom kopyalarındaki (GC/mL) AAV6 referans materyalinin konsantrasyonunu kullanarak verileri cihazın yazılımıyla analiz edin (bkz. Tablo 3). Seyreltme faktörü ile çarparak numunenin nihai konsantrasyonunu hesaplayın. Standart eğri R2’nin 1.0’a yakın olduğundan, PCR verimliliğinin% 90 -% 110 olduğundan, taban çizgisinin kaldırıldığından, erime eğrisinin tek bir tepe noktası gösterdiğinden, C t değerlerinin seyreltmelere göre değiştiğinden ve kopyaların 0.5 Ct içinde olduğundan emin olun; aksi takdirde, aykırı değerleri hariç tutun. Şekil 2’deki gibi verim bekleyin. 2. B hücre ortamı ve uyaranlarının hazırlanması Çözme ortamını hazırlayın: RPMI-1640’ı FCS ile birleştirin. 0,2 μm PES membran filtre ünitesi ile steril filtre. 4 °C’de saklayın. B hücre kültürü ortamını hazırlayın: Reaktifleri Tablo 4’te birleştirin ve ardından 0,2 μm PES membran filtre ünitesi ile steril filtreleyin. 4 °C’de saklayın. Tablo 5’teki B hücresi uyarıcılarının her birini, nükleaz içermeyen suda yeniden askıya alınması gereken CpG ODN hariç, B hücre kültürü ortamındaki stok konsantrasyonlarında yeniden askıya alın. −80 °C’de saklayın. B hücresi olmayan negatif tükenme gerçekleştiriyorsanız (isteğe bağlı adım 4), DPBS’yi (kalsiyum yok, magnezyum yok) %2 FCS (DPBS, %2 FCS) ile hazırlayın. 0,2 μm PES membran filtre ünitesi ile steril filtre. 4 °C’de saklayın. 3. Rhesus makak B hücrelerinin hazırlanması ve kültürü NOT: Kriyokorunmuş rhesus makak PBMC’ler veya splenositler hücre kültürünü oluşturmak için kullanılır30,31. 37 ° C’lik bir su banyosunda önceden ısıtılmış çözme ortamı ve B hücre kültürü ortamı. B hücresi uyarıcılarını Tablo 5’teki buz üzerinde çözün. Önceden ısıtılmış çözme ortamı içeren uygun boyutta bir tüp hazırlayın. Bu ideal olarak çözülmüş hücrelerin hacminin 10 katından fazla olmalıdır. 37 ° C’lik bir su banyosunda bir seferde bir ila iki PBMC veya splenosit kriyoviyal çözün ve önceden ısıtılmış ortamla hazırlanan tüpe boşaltın. Tüm hücreleri toplamak için kriyotüpleri durulayın. RT’de 10 dakika boyunca hücreleri 200 x g’de santrifüj edin.NOT: Bu santrifüjleme ayarları, PBMC verimini korurken trombosit kontaminasyonunu azaltır. 5 dakika boyunca 350 x g gibi daha yüksek hızlar kullanılabilir. Hücreleri yıkama için 10 mL çözme ortamında tekrar askıya alın. Donma ortamını kaldırmak için toplam üç santrifüjleme için adım 3.4 ve adım 3.5’i tekrarlayın. Son santrifüjlemeden sonra, B hücre kültürü ortamında hücreleri tahmini ~ 5 x 106 hücre / mL’de yeniden askıya alın.NOT: Yukarıdaki protokol, diğer hücreler tarafından kontaminasyona sahip tüm PBMC veya splenosit preparatlarını kültüre alır. Daha saf B hücre kültürleri gerekiyorsa, toplam B hücre veriminde önemli ölçüde azalmış olsa da, adım 4 ile devam edin. İki yöntem arasında düzenleme verimliliklerinde herhangi bir fark gözlenmemiştir. Sayma için B hücre kültürü ortamı ile gerektiğinde 10 μL hücreden oluşan bir alikotu seyreltin. Bir hemositometre ve tripan mavisi boyama kullanarak, eşit hacimlerde askıya alınmış hücreleri ve% 0.4 tripan mavisi çözeltisini birleştirerek sayın. Hücre konsantrasyonunu, hücre sayısına göre B hücre kültürü ortamı ile 3 x 106 hücre / mL’ye ayarlayın. Ardından, B hücresi uyarıcılarını Tablo 5’e göre son konsantrasyonlarına ekleyin ve karıştırın. Hücreleri uygun bir hücre kültürü kabına aktarın. Genel olarak, 0.6 x 10 6-0.7 x 106 hücre /cm2 önerilir. Hücreleri 37 ° C’de 48 saat ± 2 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin. 4. B olmayan hücrelerin isteğe bağlı negatif tükenmesi NOT: Verim ve saflık, PBMC’ler arasındaki B hücrelerinin giriş yüzdesine bağlıdır ve bu da bireysel rhesus makakları27 arasında büyük ölçüde farklılık gösterebilir. 1 x 107 PBMC’den -95 saflık, verimlilik ve 1 x 106-1,5 x 106 hücre bekleyin. Son yıkamadan sonra (adım 3.6), hücreleri DPBS% 2 FCS’de 1 x 108 hücre / mL’de ve insan Fc bloğu seyreltilmiş 1:200’de yeniden askıya alın. Hücre sayımları, çözülmüş hücrelerin sayısına dayanır. Fc reseptörlerini bloke etmek için buz üzerinde 15 dakika inkübe edin ve daha sonra biyotinile antikorları Tablo 6’ya ekleyin. Buz üzerinde 20 dakika daha kuluçkaya yatırın. Tüpü DPBS% 2 FCS ile doldurun ve 4 ° C’de 10 dakika boyunca 200 x g’de döndürün. DPBS’deki hücreleri adım 4.1’den itibaren hacmin ‘inde %2 FCS’de yeniden askıya alın (yani, 1 x 107 hücre başına 80 μL). Adım 4.1’den itibaren hacmin% 20’sinde hücre süspansiyonuna manyetik streptavidin boncukları ekleyin (yani, 1 x 107 hücre başına 20 μL boncuk). Hücreleri buz üzerinde 15 dakika boyunca inkübe edin ve ara sıra çalkalayın. Bu arada, 1 x 108 hücre başına, büyük bir manyetik tükenme sütunu ve bir ön ayırma filtresi ile manyetik bir ayırıcı hazırlayın. Ön ayırma filtresini ve kolonunu yerçekimi akışıyla 2 mL DPBS, %2 FCS ile durulayın ve akışı atın. 15 mL’lik bir toplama tüpü takın.NOT: Pozitif seleksiyon sütunları veya diğer manyetik boncuk arıtma sistemleri gibi diğer sütunların kullanılması, saflığı önemli ölçüde azaltabilir. İnkübasyondan sonra, hacim <0.5 mL ise, hücreleri DPBS% 2 FCS ile 0.5 mL'ye doldurun. Hacim ≥0,5 mL ise, devam etmeniz yeterlidir. Hücre süspansiyonunu hazırlanan kolon üzerindeki ön ayırma filtresine yükleyin ve akışı 15 mL tüpe toplayın. Ön ayırma filtresine 1 mL DPBS, %2 FCS ekleyerek bağlanmamış zenginleştirilmiş B hücrelerini iki kez temizleyin. Bağlanmamış hücreleri yerçekimi akışı ile aynı tüpe toplayın.NOT: Ek elüsyon, verimi marjinal olarak artırabilir. Saflık ve verimlilik, giriş hücrelerinin, zenginleştirilmiş hücrelerin ve kolon üzerinde tutulan hücrelerin akış sitometrisi ile değerlendirilebilir. Kolon üzerinde tutulan hücreleri elde etmek için, sütunu mıknatıstan çıkarın ve sağlanan pistonu kullanarak 3 mL DPBS% 2 FCS ile yıkayın. İstenirse, Tablo 7’deki reaktifleri kullanarak saflığı Şekil 3’teki gibi akış sitometrisi ile değerlendirin. Zenginleştirilmiş B hücrelerini 200 x g’de 4 °C’de 10 dakika boyunca santrifüj edin. B hücre kültürü ortamında hücreleri tahmini ~ 5 x 106 hücre / mL’de yeniden askıya alın ve adım 3.7’de devam edin. 5. Primer rhesus makak B hücre gen düzenleme Rhesus makak B hücrelerini 48 saat ± 2 saat boyunca aktive ettikten sonra, reaktifleri elektroporasyon ve transdüksiyon için hazırlayın.DMSO’yu önceden ısıtın, nükleaz içermeyen dubleks tampon, tampon T ve tampon E (10 μL elektroporasyon kiti) veya E2 (100 μL elektroporasyon kiti) elektroporasyon kitinden RT’ye. Tablo 5’teki rAAV6 HDRT ve B hücre uyarıcılarını buz üzerinde çözün. CRISPR-Cas9 sgRNA’larını dubleks tamponda 100 μM’de yeniden askıya alın. RT’de 10 dakika boyunca yeniden oluşturun ve vorteks ve titreşimle karıştırın. Yeniden yapılandırılmış sgRNA’ları kullanana kadar buz üzerinde tutun. −80 °C’de saklayın.NOT: CRISPR-Cas9 sgRNA’lar çeşitli çevrimiçi araçlarla tasarlanabilir (bkz. 1.1.1) ve kesme verimliliklerinde büyük farklılıklar gösterebilir. Kesme verimliliğinin ampirik testi, TIDE37 veya ICE38 gibi testler kullanılarak önerilir. 10 μL elektroporasyon başına, Tablo 5’teki tüm uyarıcılarla birlikte 550 μL B hücre kültürü ortamı hazırlayın ve% 1 DMSO ekleyin. 100 μL elektroporasyonlar için hacimleri 10 kat ölçeklendirin. İsteğe bağlı olarak, bu ortamın% 10’u antibiyotik-antimikotik olmadan hazırlanabilir, bu da transfeksiyondan sonra hücre canlılığını biraz arttırır. 10 μL elektroporasyon başına, 50 μL B hücre kültürü ortamı ile uyarıcılarla ve kullanıyorsanız antibiyotik-antimikotik içermeyen 48 delikli bir hücre kültürü plakası kuyucuğu hazırlayın. 100 μL elektroporasyonlar için, 6 delikli bir plakanın kuyucuklarına 500 μL pipet yapın. Kuyulardaki ortama, kuyudaki hacmin% 20’sine kadar rAAV6 HDRT ekleyin. Transfeksiyon başına hücre sayısına (10 μL elektroporasyon: 5 x 10 5 hücre; 100 μL elektroporasyon: 5 x 10 6 hücre) ve rAAV6 preparatındaki GC’yebağlı olarak 1 x 105-1 x 106 arasında değişen MOI’leri hedefleyin. Düşük hacimli yüksek MOI’ler elde etmek için 5 x 1013 GC/mL ila 5 x 1014 GC/mL arasında yüksek rAAV6 stok konsantrasyonları önerilir.NOT: Düşük MOI’ler düzenleme verimliliğinin düşmesine neden olabilir ve 5 x 105’lik MOI’ler genellikle gördüğümüz maksimum düzenleme verimliliğine yakındır. Değişen MOI’lerin B hücresi canlılığı üzerindeki etkisi gözlenmemiştir. rAAV6 HDRT içermeyen, RNP transfeksiyonu olmayan ve her ikisi de olmayan kontrollerin dahil edilmesi önerilir. Hazırlanan yemekleri ve kalan ortamı% 5 CO2 ile 37 ° C’de bir inkübatöre aktararak önceden ısıtın. 10 μL elektroporasyon başına 1,15 μL ribonükleoprotein (RNP) hazırlayın: Dubleks tamponda 0,75 μL 100 μM sgRNA ile 0,4 μL 61 μM Cas9’u karıştırın. Pipetleme hatası nedeniyle ve elektroporasyon uçlarını yüklerken kabarcıkları önlemek için ekstra hazırlık yapın (tek bir elektroporasyon için daha fazla tavsiye edilir). 100 μL uçlar için 10 kat ölçeklendirin. Hücrelerle karıştırmadan önce RNP’yi RT’de en az 15 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, aynı anda birden fazla lokus hedeflenecekse birden fazla RNP birleştirilebilir. Aynı anda üç lokusa kadar verimlilikte önemli bir fark gözlenmemiştir. Bu arada, hücreleri elektroporasyon için hazırlayın. Sıcaklık şoklarını önlemek için hücreleri her zaman RT’de tutun. Hücreleri 48 saat ± 2 saat kültürden sonra uygun bir kaba toplayın. Maksimum hücre sayısını toplamak için bulaşıkları DPBS ile durulayın. RT’de 10 dakika boyunca hücreleri 200 x g’de santrifüj edin. süpernatanı atın ve DPBS’deki hücreleri ~ 2 x 106 hücre / mL’de yeniden askıya alın. 10 μL tripan mavisi% 0.4 çözeltisini 10 μL hücre süspansiyonu ile birleştirin ve bir hemositometre kullanarak sayın.NOT: Bu noktada, hasat ve yıkama sırasındaki kayıp nedeniyle, 48 saat ± 2 saat önce kültüre konan hücrelerin yaklaşık% 60’ını bekleyin. Bu arada, hücreleri RT’de 10 dakika boyunca 200 x g’de santrifüj edin. Yukarıdaki hücre sayısına bağlı olarak önceden ısıtılmış (RT) tampon T’deki hücreleri 5,55 x 107 hücre/mL’de yeniden askıya alın. Makineyi açıp 1.350 V, 15 ms ve 1 darbeye ayarlayarak transfeksiyon sistemini kurun. Pipet istasyonunu laminer akış davlumbazının içine yerleştirin Her 10 elektroporasyon seti için, 3 mL tampon E (10 μL transfeksiyon için) veya E2 (100 μL transfeksiyon için) içeren bir transfeksiyon tüpü hazırlayın. Tüpü pipet istasyonuna yerleştirin. 10 μL elektroporasyon başına, 1.15 μL RNP’yi 9 μL hücre ile birleştirin. Elektroporasyon ucuna hava girmesini önlemek için yeterli hacme (+ ) sahip olduğunuzdan emin olun. Elektroporasyondan önce RT’de 1-2 dakika inkübe edin. 10 μL veya 100 μL RNP ve hücre karışımını bir elektroporasyon pipeti üzerindeki uygun boyuttaki elektroporasyon ucuna aspire edin, yüklü pipeti pipet istasyonuna yerleştirin ve elektroporasyonu başlatın. Arklanmayı önlemek için uçların tamamen hava kabarcıklarından arındırılmış olduğundan emin olun. Arklanmanın oluşmadığını doğrulamak için elektroporasyon sırasında izleyin. Elektropora hücreleri derhal 48 delikli (10 μL transfeksiyonlar) veya 6 delikli plaka (100 μL transfeksiyonlar) içinde rAAV6 ile veya rAAV6 olmadan hazırlanmış, önceden ısıtılmış, küçük hacimli ortama çıkarın. 5.15-5.17 arasındaki adımları kalan örneklerle yineleyin. Kültür kuyularına transfeksiyon olmadan kontrol numuneleri ekleyin. Hücreleri 37 ° C’de 4 saat ± 2 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin ve ardından uyarıcılar, DMSO ve antibiyotik / antimikotik içeren hazırlanmış, önceden ısıtılmış B hücre kültürü ortamını ekleyin: 10 μL transfeksiyonlar için 450 μL veya 100 μL transfeksiyonlar için 4.5 mL. Kuluçka işlemine 37 ° C’de 12-24 saat boyunca% 5 CO2 ile devam edin. Daha sonra, genişletilmiş kültürleme isteniyorsa, ortamı uyarıcılar ve DMSO içermeyen antibiyotik / antimikotik içeren B hücre kültürü ortamına değiştirin. Genomik DNA’nın analizi 24 saat sonra yapılabilir. Homoloji kolunun dışında bir astar ve kesici ucun içinde bir astar kullanan dijital damlacık PCR, düzenleme verimliliğini ölçmek için kullanılabilir39. Ekleme bölgesini yükseltmek için PCR’ler ve doğru düzenlemeyi doğrulamak için Sanger dizilimini gerçekleştirin. Protein seviyelerinin analizi için, protein ekspresyonu değişikliklerine izin vermek için elektroporasyondan sonra hücreleri 40-48 saat boyunca kültürleyin ve Tablo 7’deki reaktifleri kullanarak akış sitometrisi ile bir analiz yapın.