Edición génica de células B primarias de macaco Rhesus

Todos los procedimientos y experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud. En la figura 1 se presenta un resumen de los siguientes protocolos. Los macacos rhesus machos y hembras (Macaca mulatta) de origen genético indio de 2 a 8 años de edad fueron alojados y atendidos de acuerdo con las directrices del Comité sobre el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio en una instalación de nivel 2 de bioseguridad. PRECAUCIÓN: Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las precauciones universales para patógenos transmitidos por la sangre, con técnicas estériles / asépticas y equipos adecuados de nivel 2 de bioseguridad en campanas de flujo laminar. 1. Producción de rAAV6 Prepare los reactivos para la producción de rAAV6.Diseñar y clonar la plantilla de reparación dirigida por homología entre las repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV2 en el vector pAAV utilizando técnicas estándar. Asegúrese de que los brazos de homología sean de al menos ~ 250 pb en cada lado, pero tan poco como 60 pb puede ser suficiente, aunque se prefieren brazos de homología más largos si el diseño de construcción lo permite. Si las secuencias objetivo de cualquiera de los sgRNAs utilizados están presentes en el HDRT, elimínelas utilizando mutaciones silenciosas, que son más efectivas en el motivo adyacente del protoespaciador o la región semilla del sitio objetivo.NOTA: Se puede realizar la síntesis de genes combinada con el ensamblaje de Gibson para una clonación eficiente32. Preparar un Maxiprep de un clon correcto para la transfección. Para el diseño de sgRNA, se recomienda CHOPCHOP33, y se puede encontrar una lista de más herramientas en https://zlab.bio/guide-design-resources. La capacidad máxima de empaquetado para AAV incluyendo ITRs es ~4.7 kb. AAV6 es el serotipo más comúnmente utilizado para editar células hematopoyéticas, particularmente células B9. No se han probado otros serotipos de AAV para la edición génica de células B de macaco rhesus, pero AAV28 y AAV-DJ10,11 se han utilizado en estudios con ratones. Preparar el medio de cultivo y el medio de producción 293AAV de acuerdo con la Tabla 1 y la Tabla 2. Filtro estéril a través de una unidad de filtro de membrana de polietersulfona (PES) de 0,2 μm. Conservar a 4 °C. Prepare 1x solución de polietilenimina (PEI) (1 mg/ml, 100 ml). En un vaso de precipitados de vidrio de 250 ml, caliente ~ 70 ml deH2Oen un microondas durante ~30 s y luego agregue 100 mg de PEI. Agregue un agitador magnético y revuelva hasta que el PEI se disuelva por completo. Ajuste el pH a 7 con 1 M HCl, luego rellene hasta 100 ml con H2O, espere 10 minutos, verifique el pH nuevamente y ajuste si es necesario. Filtrar estéril la solución de PEI a través de una unidad de filtro de membrana PES de 0,2 μm, alícuota y almacenar a -20 °C. Después de la descongelación, la solución puede conservarse a 4 °C durante un máximo de 2 meses. Prepare 5 soluciones de polietilenglicol (PEG)/NaCl. Pesar 400 g de PEG 8.000 y 24 g de NaCl. Agregue un agitador magnético a un vaso de precipitados de vidrio de 2 L, agregue el PEG 8,000 y NaCl pesados, y enjuague con ~ 550 ml de agua desionizada. Revuelva con el calentamiento y lleve a ebullición o 80-90 °C hasta que se disuelva por completo. Ajuste el pH a ~7.4 con 1 M NaOH, luego ajuste el volumen a 1 L usando un cilindro de medición y transfiéralo a una botella de vidrio de 2 L con el agitador magnético. Autoclave la botella, el agitador magnético y la solución en un baño maría durante 30 min a 121 °C. Después del autoclave, enfríe la solución en una cámara frigorífica mientras agita con el agitador magnético para evitar la separación en diferentes fases. Alícuota en caso necesario y conservar a 4 °C. Prepare el tampón de formulación. Mezclar 500 mL de DPBS con 50 μL de Pluronic F-68 al 10%. Filtro estéril a través de una unidad de filtro de membrana PES de 0,2 μm y almacenar a temperatura ambiente (RT). Cultivo celular, transfección y transducción para la producción de rAAV6Descongelar, cultivar y congelar células 293AAV según lo descrito por el fabricante utilizando el medio de cultivo 293AAV anterior y tripsina-EDTA para la división. Se recomienda congelar algunos pasajes tempranos y usar las células para la producción de AAV antes de que alcancen el paso 40. Para la producción de rAAV6, siembre cuatro placas de cultivo celular de 15 cm con 5 x 106 células en 30 ml cada una. Las células están listas para la transfección generalmente 1-2 días después de la siembra cuando alcanzan el 80% -90% de confluencia. Descongele un Maxiprep de plásmido pAAV que contiene el HDRT para ser empaquetado en AAV6. Resuspender 85,6 μg del plásmido pAAV en 3 ml de medio DMEM puro. Disuelva 342 μL de 1 mg/ml de solución de PEI en 3 ml de medio DMEM puro. Incubar ambas soluciones durante 10 minutos en RT. Mezclar ambos tubos de 3 ml en un tubo de ~6,4 ml de mezcla de transfección, e incubar durante 20 minutos en RT. Mientras tanto, descongele el vector auxiliar autosilenciable habilitado para tetraciclina RepCap6 del congelador de -80 °C en un baño de agua a 37 °C. Para transducir las células 293AAV, agregue el vector auxiliar a una multiplicidad de infección (MOI) de 25 utilizando la dosis infecciosa mediana de cultivo tisular (TCID 50) y suponiendo 1.15 x10 7 células/plato; típicamente, se usan 2-10 μL por plato de 15 cm. Mece y agita los platos suavemente para distribuirlos. Después de la incubación de la mezcla de transfección, añadir 1,6 ml gota a gota en cada uno de los cuatro platos de 15 cm. Incubar a 37 °C y 5% deCO2 durante la noche.NOTA: Alternativamente, si los vectores de interés rAAV6 ya están disponibles, estos vectores se pueden usar para proporcionar el genoma viral que se va a empaquetar, lo que niega la necesidad de plásmidos con este sistema y produce títulos de rAAV6 comparables. Para este enfoque, las células 293AAV se cotransducen con el rAAV6 deseado a un MOI de 50 (basado en copias del genoma rAAV6 [GC] / mL) junto con el vector ayudante. Al día siguiente, aspirar y desechar cuidadosamente el medio de cultivo, y reemplazar con 30 ml de medio de producción precalentado. Incubar durante otras 96 h antes de la cosecha. No se recomienda ningún cambio medio adicional para maximizar los rendimientos. Cosecha y purificación del AAV6 recombinante del medioSin desalojar las células del plato, recoja todo el sobrenadante celular en una unidad de filtro con una membrana PES de 0,2 μm al menos un 50% más grande que el volumen de medio a filtrar. Luego, filtre el sobrenadante.NOTA: Si se desean mayores rendimientos de rAAV6, las células pueden ser cosechadas y el rAAV extraído del pellet celular utilizando kits comerciales o protocolos establecidos34,35. Dado que AAV6 se secreta principalmente en el medio36, solo se usó sobrenadante, reduciendo la mano de obra, el costo y el tiempo. Agregue 5 veces la solución de PEG/NaCl al sobrenadante filtrado al 25% del volumen recolectado; esto es típicamente 30 ml si se usan cuatro platos de 15 cm de 30 ml. Mezclar bien invirtiendo y luego incubar durante la noche a 4 °C para precipitar las partículas virales.NOTA: Las partículas de AAV son estables hasta por 2 días en esta solución. Preenfríe una centrífuga de cubo oscilante con 250 ml de insertos de tubo a 4 °C. Preparar una unidad de filtro centrífugo de 4 ml con un corte de 100 kDa y un filtro de jeringa PES hidrófilo de 0,22 μm pretratando cada membrana con 2 ml de Pluronic F-68 al 10% durante al menos 1 h en RT. Transfiera la mezcla AAV-PEG/NaCl a un tubo de 250 ml, centrifugar a 2.500 x g durante 1 h a 4 °C y, a continuación, retirar con cuidado todo el sobrenadante por aspiración. Resuspender el pellet viral beige a blanco mediante vórtice en 4 mL de 1 M HEPES hasta que esté completamente resuspendido. Si es necesario, déjelo reposar durante 5 minutos y vuelva a voráctel. Resuspender con una pipeta serológica de 5 ml y transferir el volumen total a un tubo de 15 ml. En una campana extractora, agregue un volumen igual de cloroformo a la suspensión del virus, típicamente 4 ml. Vigorosamente vórtice durante 2 min, y luego centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a RT. Recoja la capa superior (sobrenadante que contiene AAV) en un tubo nuevo de 50 ml y deseche la capa inferior (cloroformo).PRECAUCIÓN: Las soluciones que contienen cloroformo son residuos peligrosos. Seguir las directrices institucionales para su eliminación. Coloque el sobrenadante que contiene AAV debajo de una campana extractora y deje que el cloroformo restante se evapore durante 30 minutos. Mientras tanto, lave la unidad de filtro centrífugo pretratado y el filtro de la jeringa. Agregue 1.5 ml de tampón de formulación a la unidad de filtro centrífugo pretratada. Centrífuga a 3.500 x g durante 10 min a 15 °C en un rotor de cangilón oscilante. Repita este paso con 4 ml de tampón de formulación para lavar la membrana. Enjuague el filtro de la jeringa dos veces con 5 ml de tampón de formulación con una jeringa de 5 ml. Cargue los ~4 ml de sobrenadante que contiene AAV de la extracción con cloroformo en una jeringa de 5 ml, conecte el filtro de la jeringa lavada y filtre directamente en la unidad de filtro centrífugo. Centrifugar a 3.500 x g durante 25 min a 15 °C, y luego confirmar que la solución AAV en el filtro está entre 50-100 μL. Si el volumen de la solución es >100 μL, continúe centrifugando. Después de retirar el filtrado, agregue 4 ml de tampón de formulación dentro de la taza de la unidad de filtro centrífugo y mezcle la solución uniformemente mediante pipeteo. Centrifugar a 3.500 x g durante 25 min a 15 °C, y luego confirmar que la solución AAV en el filtro está entre 50-100 μL. Si el volumen de la solución es >100 μL, continúe centrifugando. Repita este paso para otro lavado. Después de la centrifugación final, confirme que el volumen de la solución es de 50-70 μL; Si no, continúe centrifugando. Transfiera la preparación a un tubo de 1,5 ml. Alícuota si lo desea, y conservar a −80 °C. Determinación del título AAV6 recombinante por qPCRNOTA: Los cebadores qPCR se reproducen en la región ITR y, por lo tanto, deben ser adecuados para todas las construcciones clonadas en pAAV.Descongelar una alícuota del rAAV6 que se va a valorar y una alícuota del material de referencia AAV6. El material de referencia AAV6 debe estar cerca de 4 x 1011 GC/mL; de lo contrario, ajuste las diluciones en consecuencia. Realice una digestión de DNasa I para eliminar cualquier resto de ADN plásmido libre en la preparación de rAAV6 combinando 2.0 μL de la muestra o material de referencia AAV6 con 15.6 μL deH2Olibre de nucleasa, 2.0 μL de tampón DNasa I 10x y 0.4 μL de DNasa I. Mezclar suavemente e incubar durante 30 minutos a 37 °C, y luego transferir al hielo. Esta es la dilución 1 (ver Tabla 3). Preparar diluciones en serie quíntuples de todas las muestras y del material de referencia AAV6 como se indica en la Tabla 3 a continuación con agua. Prepare una mezcla maestra de qPCR SYBR Green. Por pozo, mezclar 4,7 μL de agua libre de nucleasas con 10 μL de mezcla maestra SYBR Green, 0,15 μL de cebador ITR hacia adelante a 100 μM y 0,15 μL de cebador ITR inverso a 100 μM.NOTA: Cada muestra se mide por duplicado, con 16 pozos para el estándar de referencia, 8 pozos por muestra y 2 pozos para un control sin plantilla. Prepare un 10% más de mezcla maestra para tener en cuenta el error de pipeteo. En una placa de reacción óptica de 96 o 384 pocillos, cargue 15 μL/pocillo de la mezcla maestra de qPCR SYBR Green. A continuación, cargue 5 μL de muestras y material de referencia AAV6 o agua libre de nucleasas para el control sin plantilla. Para el estándar de referencia AAV6, carga dilución 2 a dilución 9. Para las muestras, carga dilución 5 a dilución 8. Mida cada dilución por duplicado. Evita las burbujas. Selle la placa cargada con una película óptica transparente, centrifugar a 800 x g durante 1 minuto a RT y cargar la placa en el instrumento qPCR con la configuración adecuada de 96 o 384 pocillos. Configure y ejecute el instrumento qPCR utilizando la detección SYBR con las siguientes condiciones de ciclo: 98 °C durante 3 min, luego 40 ciclos de 98 °C durante 15 s y 58 °C durante 30 s, seguidos de una curva de fusión. Analice los datos con el software del instrumento utilizando la concentración del material de referencia AAV6 en copias del genoma por milímetro (GC/mL) como curva estándar (ver Tabla 3). Calcular la concentración final de la muestra multiplicando por el factor de dilución. Asegúrese de que la curva estándar R2 esté cerca de 1.0, la eficiencia de PCR sea del 90% -110%, se haya eliminado la línea de base, la curva de fusión muestre un solo pico, los valores de C t cambien de acuerdo con las diluciones y los duplicados estén dentro de 0.5 Ct; de lo contrario, excluya los valores atípicos. Espere rendimientos como en la Figura 2. 2. Preparación de medios y estímulos de células B Preparar medio de descongelación: Combine RPMI-1640 con 20% FCS. Filtro estéril a través de una unidad de filtro de membrana PES de 0,2 μm. Conservar a 4 °C. Preparar el medio de cultivo de células B: Combine los reactivos de la Tabla 4 y luego el filtro estéril a través de una unidad de filtro de membrana PES de 0,2 μm. Conservar a 4 °C. Resuspender cada uno de los estimulantes de células B de la Tabla 5 a concentraciones madre en medio de cultivo de células B, excepto CpG ODN, que debe resuspenderse en agua libre de nucleasas. Conservar a -80 °C. Si realiza una depleción negativa de células no B (paso opcional 4), prepare DPBS (sin calcio, sin magnesio) con FCS al 2% (DPBS 2% FCS). Filtro estéril a través de una unidad de filtro de membrana PES de 0,2 μm. Conservar a 4 °C. 3. Preparación y cultivo de células B de macaco rhesus NOTA: Se utilizan PBMCs o esplenocitos de macaco rhesus criopreservados para configurar el cultivo celular30,31. Precaliente el medio de descongelación y los medios de cultivo de células B en un baño maría a 37 °C. Descongele los estimulantes de células B de la Tabla 5 en hielo. Prepare un tubo del tamaño adecuado que contenga un medio de descongelación precalentado. Idealmente, esto debería ser más de 10 veces el volumen de las células descongeladas. Descongele uno o dos crioviales de PBMC o esplenocitos a la vez en un baño de agua a 37 °C, y decanten en el tubo preparado con medio precalentado. Enjuague los criotubos para recoger todas las células. Centrifugar las células a 200 x g durante 10 min en RT.NOTA: Estos ajustes de centrifugación reducen la contaminación plaquetaria al tiempo que preservan los rendimientos de PBMC. Se pueden usar velocidades más altas, como 350 x g durante 5 minutos. Resuspender las células en medio de descongelación de 10 ml para el lavado. Repita los pasos 3.4 y 3.5 para un total de tres centrifugaciones para eliminar el medio de congelación. Después de la última centrifugación, resuspender las células a un estimado de ~5 x 106 células/ml en medio de cultivo de células B.NOTA: El protocolo anterior cultiva preparaciones enteras de PBMC o esplenocitos con contaminación por otras células. Si se requieren cultivos de células B más puros, aunque con rendimientos totales de células B significativamente reducidos, continúe con el paso 4. No se han observado diferencias en las eficiencias de edición entre los dos métodos. Diluir una alícuota de 10 μL de células según sea necesario con medio de cultivo de células B para el recuento. Contar con hemocitómetro y tinción de azul de tripano, combinando volúmenes iguales de células resuspendidas y solución de azul de tripano al 0,4%. Ajustar la concentración celular a 3 x 106 células/ml con medio de cultivo de células B según el recuento celular. Luego, agregue los estimulantes de células B a sus concentraciones finales de acuerdo con la Tabla 5 y mezcle. Transfiera las células a una placa de cultivo celular apropiada. En general, se recomienda 0,6 x 10 6-0,7 x 106 células/cm2. Incubar las células a 37 °C con 5% deCO2 durante 48 h ± 2 h. 4. Agotamiento negativo opcional de células no B NOTA: El rendimiento y la pureza dependen del porcentaje de entrada de células B entre las PBMC, que puede diferir drásticamente entre los macacos rhesus individuales27. Espere 80% -95% de pureza, 60% de eficiencia y 1 x 10 6-1.5 x 106 celdas de 1 x 107 PBMC. Después del último lavado (paso 3.6), resuspender las células a 1 x 108 células/ml en DPBS 2% FCS y Fc-block humano diluido 1:200. Los recuentos de células se basan en el número de células descongeladas. Incubar durante 15 minutos en hielo para bloquear los receptores Fc, y luego añadir los anticuerpos biotinilados en la Tabla 6. Incubar durante otros 20 minutos en hielo. Rellene el tubo con DPBS 2% FCS y gire a 200 x g durante 10 min a 4 °C. Resuspender las células en DPBS 2% FCS al 80% del volumen del paso 4.1 (es decir, 80 μL por 1 x 107 células). Agregue perlas magnéticas de estreptavidina a la suspensión celular al 20% del volumen desde el paso 4.1 (es decir, 20 μL de perlas por 1 x 107 células). Incubar las células durante 15 minutos en hielo y agitar ocasionalmente. Mientras tanto, por 1 x 108 celdas, prepare un separador magnético con una gran columna de agotamiento magnético y un filtro de preseparación. Enjuague el filtro y la columna de preseparación con 2 ml de DPBS 2% FCS por flujo por gravedad, y deseche el flujo continuo. Instale un tubo de recolección de 15 ml.NOTA: El uso de otras columnas, como columnas de selección positiva u otros sistemas de purificación de perlas magnéticas, puede reducir drásticamente la pureza. Después de la incubación, rellene las células a 0,5 ml con DPBS 2% FCS si el volumen es <0,5 ml. Si el volumen es ≥0.5 ml, simplemente proceda. Cargue la suspensión de la celda en el filtro de preseparación en la columna preparada y recoja el flujo en el tubo de 15 ml. Eluya las células B enriquecidas no unidas dos veces agregando 1 ml de DPBS 2% FCS en el filtro de preseparación. Recoger las células no unidas en el mismo tubo por flujo de gravedad.NOTA: La elución adicional puede aumentar marginalmente el rendimiento. La pureza y la eficiencia pueden evaluarse mediante la citometría de flujo de las células de entrada, las células enriquecidas y las células retenidas en la columna. Para obtener las células retenidas en la columna, retire la columna del imán y enjuague con 3 ml de DPBS 2% FCS utilizando el émbolo provisto. Si se desea, evalúe la pureza por citometría de flujo como en la Figura 3 utilizando los reactivos de la Tabla 7. Centrifugar las células B enriquecidas a 200 x g durante 10 min a 4 °C. Resuspender las células a un estimado de ~5 x 106 células/ml en medio de cultivo de células B y continuar en el paso 3.7. 5. Edición primaria del gen de células B del macaco rhesus Después de activar las células B del macaco rhesus durante 48 h ± 2 h, preparar los reactivos para electroporación y transducción.Precaliente DMSO, tampón dúplex libre de nucleasa, tampón T y tampón E (kit de electroporación de 10 μL) o E2 (kit de electroporación de 100 μL) desde el kit de electroporación a RT. Descongele los estimulantes de células RAAV6 HDRT y B de la Tabla 5 en hielo. Resuspender los sgRNAs de CRISPR-Cas9 a 100 μM en tampón dúplex. Reconstituir durante 10 minutos en RT, y mezclar por vórtice y movimiento. Mantenga los sgRNAs reconstituidos en hielo hasta su uso. Conservar a -80 °C.NOTA: Los sgRNAs de CRISPR-Cas9 se pueden diseñar con varias herramientas en línea (ver 1.1.1) y pueden variar drásticamente en su eficiencia de corte. Se recomienda realizar pruebas empíricas de la eficiencia de corte utilizando ensayos como TIDE37 o ICE38. Por 10 μL de electroporación, preparar 550 μL de medio de cultivo de células B con todos los estimulantes de la Tabla 5, y añadir DMSO al 1%. Escale los volúmenes 10 veces para electroporaciones de 100 μL. Opcionalmente, el 10% de este medio se puede preparar sin antibiótico-antimicótico, lo que aumenta ligeramente la viabilidad celular después de la transfección. Por electroporación de 10 μL, preparar un pocillo de una placa de cultivo celular de 48 pocillos con 50 μL del medio de cultivo de células B con estimulantes y sin antibiótico-antimicótico, si se utiliza. Para electroporaciones de 100 μL, pipetear 500 μL en los pocillos de una placa de 6 pocillos. Agregue rAAV6 HDRT al medio en los pozos, hasta el 20% del volumen en el pozo. Apunte a los MOI que van desde 1 x 10 5-1 x 106 según el número de células por transfección (electroporación de 10 μL: 5 x 105 células; electroporación de 100 μL:5 x 106 células) y el GC en la preparación rAAV6. Se recomiendan altas concentraciones madre de rAAV6 de 5 x 1013 GC/ml a 5 x 1014 GC/ml para lograr MOI altos con volúmenes bajos.NOTA: Los MOI más bajos pueden conducir a una eficiencia de edición reducida, y los MOI de 5 x 105 generalmente están cerca de las eficiencias de edición máximas que hemos visto. No se ha observado una influencia de los MOI variables en la viabilidad de las células B. Se recomienda incluir controles sin rAAV6 HDRT, sin transfección RNP y sin ambos. Precaliente los platos preparados y el medio restante transfiriéndolos a una incubadora a 37 °C con 5% deCO2. Por 10 μL de electroporación, preparar 1,15 μL de ribonucleoproteína (RNP): Mezclar 0,4 μL de 61 μM Cas9 con 0,75 μL de 100 μM sgRNA en tampón dúplex. Preparar extra (se recomienda un 30% más para una sola electroporación) debido al error de pipeteo y para evitar burbujas al cargar las puntas de electroporación. Báscula 10 veces para puntas de 100 μL. Incubar el RNP durante al menos 15 minutos en RT antes de mezclarlo con las células. Después de la incubación, se pueden combinar múltiples RNP si se va a dirigir simultáneamente más de un locus. No se han observado diferencias significativas en la eficiencia con hasta tres loci al mismo tiempo. Mientras tanto, prepare las células para la electroporación. Mantenga las celdas en RT en todo momento para evitar choques de temperatura. Cosechar las células después de 48 h ± 2 h de cultivo en un recipiente apropiado. Enjuague los platos con DPBS para recoger el número máximo de células. Centrifugar las células a 200 x g durante 10 min a RT. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en DPBS a ~2 x 106 células/ml. Combine 10 μL de solución de azul de tripano al 0,4% con 10 μL de la suspensión celular y cuente con un hemocitómetro.NOTA: En este punto, debido a la pérdida durante la cosecha y el lavado, espere alrededor del 60% de las células que se pusieron en cultivo 48 h ± 2 horas antes. Mientras tanto, centrifugar las células a 200 x g durante 10 minutos en RT. Deseche el sobrenadante, asegurándose de minimizar cualquier DPBS restante. Resuspender las células en tampón T precalentado (RT) a 5,55 x 107 células/ml en función del recuento de células anterior. Configure el sistema de transfección encendiendo la máquina y ajustándola a 1.350 V, 15 ms y 1 pulso. Coloque la estación de pipetas dentro de la campana de flujo laminar Para cada serie de 10 electroporaciones, preparar un tubo de transfección con 3 ml de tampón E (para transfecciones de 10 μL) o E2 (para transfecciones de 100 μL). Inserte el tubo en la estación de pipetas. Por 10 μL de electroporación, combinar 1,15 μL de RNP con 9 μL de células. Asegúrese de tener un volumen suficiente (+ 30%) para evitar aspirar aire en la punta de electroporación. Incubar a RT durante 1-2 min antes de la electroporación. Aspirar 10 μL o 100 μL de RNP y mezcla celular en la punta de electroporación del tamaño adecuado en una pipeta de electroporación, insertar la pipeta cargada en la estación de pipetas e iniciar la electroporación. Asegúrese de que las puntas estén completamente libres de burbujas de aire para evitar la formación de arcos. Observe durante la electroporación para verificar que no se produzca un arco eléctrico. Expulsar inmediatamente las células electroporadas en el pequeño volumen de medio preparado, precalentado con o sin rAAV6 dentro de la placa de 48 pocillos (transfecciones de 10 μL) o de 6 pocillos (transfecciones de 100 μL). Repita los pasos 5.15-5.17 con las muestras restantes. Añadir muestras de control sin transfección a los pocillos de cultivo. Incubar las células a 37 °C con 5% deCO2 durante 4 h ± 2 h, y luego añadir el medio de cultivo de células B precalentado preparado que contiene estimulantes, DMSO y antibióticos/antimicóticos: 450 μL para transfecciones de 10 μL o 4,5 ml para transfecciones de 100 μL. Continuar la incubación a 37 °C con 5% de CO2 durante12-24 h. Luego, cambie el medio a medio de cultivo de células B que contenga estimulantes y antibióticos/antimicóticos sin DMSO si se desea un cultivo prolongado. El análisis del ADN genómico se puede hacer después de 24 h. La PCR digital de gotas utilizando un cebador fuera del brazo de homología y un cebador dentro del inserto se puede utilizar para cuantificar la eficiencia de edición39. Realice PCR para amplificar el sitio de inserción y secuenciación de Sanger para verificar la edición correcta. Para el análisis de los niveles de proteína, cultivar las células durante 40-48 h después de la electroporación para permitir cambios en la expresión de proteínas, y realizar un análisis por citometría de flujo utilizando los reactivos de la Tabla 7.