유충 제브라피쉬의 표적 신호 반응 모니터링 - Z-REX는 친전자성 약물 및 대사 산물의 정확한 메커니즘을 밝힙니다.

미국 코넬 대학교의 제브라피쉬 사육 및 취급 절차는 미국 국립보건원(NIH)의 지침에 따라 수행되었으며 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 스위스 연방 공과 대학 로잔 (EPFL, 스위스)의 제브라 피쉬 부서에서 제브라 피쉬 사육 및 취급 절차는 동물 복지법 SR 455 및 동물 복지 조례 SR 455.1에 따라 수행되었으며 주 수의사 승인 VD-H23이 있습니다. 참고: 이 프로토콜에서는 Halo-TeV-Keap1을 발현하는 Tg (lyz:TagRFP ) 및 Tg(mpeg1:EGFP) 피쉬 라인을 사용하여 Z-REX를 시연합니다. 이 방법은 다른 관심 단백질, 형질전환 리포터 낚싯줄 및 다운스트림 생물학적 분석으로 확장될 수 있습니다. 본 연구에 사용된 완충액에 대해서는 보충표 1 을 참조한다. 모든 시약, 기구, 장비, 항체, 플라스미드, 제브라피쉬 균주 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다. 1. mRNA 준비 mMessage mMachine SP6 in vitro transcription kit를 사용하여 Halo-TeV-Keap1-2xHA 및 Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA mRNA를 준비합니다.참고: 제조업체의 지침에 따라 각 mRNA에 대해 40μL 스케일 반응을 수행합니다. mRNA 펠릿을 뉴클레아제가 없는 물 10μL에 재용해합니다. mRNA 품질을 평가하고 마이크로볼륨 분광광도계 및 아가로스 겔 전기영동으로 농도를 측정합니다. 좋은 품질의 mRNA는 약2.0 이상의 A 260/A280 비율을 가져야 합니다. 뉴클레아제가 없는 물로 mRNA를 1-1.5 mg/mL로 희석합니다. mRNA 용액을 분취하고(튜브당 1-2 μL), 분취액을 -80°C에서 보관한다. 2. 어류 배아 생산 옵션 1 : 야생형 (WT) 어류 배아 생산.10개의 개별 수조에 10쌍의 물고기 횡단쌍을 설치하고, 각 수조에는 수컷과 암컷 부모 물고기 사이에 칸막이가 있습니다.참고: 총 10개의 교차 쌍은 일반적으로 분석을 위한 충분한 수의 배아를 제공합니다. 교배 쌍의 수는 실험 설계/필요 및 부모 물고기의 번식력에 따라 조정할 수 있습니다. 다음날 아침, 인젝터를 설치한 후 5개의 탱크에 있는 칸막이를 제거합니다. 물고기가 짝짓기를 할 때까지 30분 동안 기다립니다. 부모 물고기를 다른 수조로 옮기고 수조 물을 여과기에 통과시켜 배아를 채취한 다음 여과기에서 배아를 10cm 페트리 접시로 헹굽니다. 이 배아는 첫 번째 주사에 사용됩니다.참고: 특정 배치의 난자 품질이 좋지 않은 경우(예: 단백질 응집으로 인해 난자가 불투명한 경우) 다른 배아와 함께 풀링하지 마십시오. (선택 사항) 다음 주입을 위해 다른 5개의 탱크에서 2.1.2-2.1.3단계에 설명된 것과 유사한 절차를 수행합니다.참고: 배아 간의 연령 차이를 최소화하기 위해 한 번만 주사하는 것이 가장 좋습니다. 그러나 한 로트에 주입할 수 있는 것보다 더 많은 배아가 필요한 경우 mRNA 주입 중에 배아가 1-4-세포 단계에 남아 있도록 두 차례의 주입을 수행하는 것이 좋습니다. 주입 라운드 수는 작업자의 주입 기술 및 실험 설계에 따라 조정할 수 있습니다. 그러나 2 시간 이내에 전체 절차 (첫 번째 분배기 제거에서 마지막 배아 주입까지)를 수행하는 것이 좋습니다. 배아에 따른 연령 차이가 크면 실험 결과의 신뢰성과 재현성이 손상될 수 있습니다. 옵션 2: 이형접합체 형질전환 호중구/대식세포 리포터 물고기 배아 생산.10개의 개별 수조에 10개의 어종 교차 쌍을 설정하고 각 수조에는 수컷과 암컷 어미 어류 사이에 WT 물고기 대 Tg( lyz:TagRFP) 또는 WT 물고기 대 Tg(mpeg1:eGFP)와 같은 구분선이 삽입됩니다.참고: 동형접합 리포터 물고기는 이형접합체 물고기에 비해 더 높은 형광 신호를 나타내므로 다운스트림 형광 판독값에 영향을 미칠 수 있는 이형접합 형질전환 물고기 사이의 교배를 피하십시오. 형질전환 리포터 라인과 WT 배아는 이미징 시 쉽게 구별할 수 있습니다. 동일한 풀에 WT와 이형 접합 배아가 혼합되어 있는 것은 문제가 되지 않습니다. lyz:TagRFP 는 호중구를 보고하고 mpeg:eGFP는 대식세포를 보고합니다. 이 프로토콜은 다른 리포터 낚싯줄에도 적용할 수 있습니다. 2.1.2-2.1.4단계를 따릅니다. 3. 마이크로 인젝터 설정 공기 공급원을 켜고 배압을 0.2-0.5psi로 설정하고 사출 압력을 25-30psi로 설정합니다. 표시된 특정 압력 범위가 일반적으로 권장됩니다.알림: 물고기 매체가 바늘로 역류하는 것을 방지하기 위해 안정적인 배압을 갖는 것이 중요합니다. 3.8단계에서 주입량을 보정할 때 주입 시간만 변경해야 합니다. 다음 단계에서 사출 압력을 변경하지 마십시오. 낮은 주입 압력은 표면 및 계면 장력으로 인한 주입 실패로 이어질 수 있는 반면, 높은 주입 압력은 배아를 손상시킬 수 있습니다. RNase 오염 제거 용액으로 장비와 주입 플랫폼을 청소하십시오.참고: mRNA를 분해하는 RNase는 작업자 또는 장비에서 나올 수 있습니다. 실험 전에 청소를 수행하고 장갑을 착용해야합니다. (선택 사항) mRNA와 모르폴리노를 함께 주입하는 경우 0.2mL 튜브에서 둘을 미리 혼합합니다.참고: Z-REX는 250-1500ng/μL 농도의 Halo-TeV-Keap1-2xHA mRNA 용액을 사용하여 잘 작동합니다. 제브라피쉬에도 여러 모르폴리노가 사용되었으며, 최적의 농도가 보고되었다7. 미공개 염기서열을 가진 모르폴리노를 사용하는 경우, 작업자는 Z-REX에서 모르폴리노를 사용하기 전에 먼저 모르폴리노의 독성 및 유전자 녹다운 효율을 평가해야 합니다. 1-2 μL의 mRNA(및/또는 해당되는 경우 모르폴리노7)를 마이크로 로더 피펫 팁이 있는 주사 바늘에 옮깁니다.알림: Flaming/Brown 마이크로피펫 풀러로 바늘을 준비하는 경우 설정은 다음과 같습니다. 열: 520 단위; 잡아당기기 힘: 60 단위; 속도: 70 단위; 지연: 155 단위; 압력: 550 단위; 경사로: 530 단위. 미세주입 매니퓰레이터에 바늘을 설치합니다.알림: 공기 공급원의 배압은 mRNA(/morpholino) 용액을 바늘 끝으로 밀어 넣어야 합니다. 날카로운 집게나 면도날을 사용하여 바늘 끝을 부러뜨리고 주사하기에 적합한 구멍을 만듭니다. 바늘 끝을 스테이지 마이크로미터의 미네랄 오일에 담그십시오. 팁의 기포를 제거하기 위해 두세 개의 주입 펄스를 적용합니다. 주입 시간을 변경하여 입자 크기를 2nL로 보정합니다.참고: 이것은 혈구계에 놓인 미네랄 오일(난황낭의 점도를 모방함)에 주입하여 수행하는 것이 가장 좋습니다. 현미경을 사용하여 혈구계의 격자선을 사용하여 주입 중에 형성된 액적의 크기를 추정하고 그에 따라 주입 시간을 조정합니다. 페놀 레드 염료가 때때로 사용되지만, 여기에 설명 된 mRNA 주입 절차에서 그 필요성은 관찰되지 않았다. 4. 미세주입 주입 플레이트에 신선한 10% Hank’s balanced salt solution(HBSS) 배지를 채우고 플레이트의 홈에 있는 배아를 뭉툭한 집게로 맞춥니다.참고: 주입 플레이트는 10% HBSS 배지에서 2% 아가로스로 제조됩니다. 홈은 플라스틱 몰드를 사용하여 형성됩니다. 주사판의 10% HBSS 배지에 바늘 끝을 담그십시오. 팁의 기포를 제거하기 위해 두세 개의 주입 펄스를 적용합니다. 각 주사에 대해 한 번의 움직임으로 융모막과 난황낭을 관통하고 주입 펄스를 적용합니다. 이 주입된 액체는 주사 직후 난황낭 내에 작은 스페로이드로 볼 수 있습니다. 이 작은 스페로이드는 비교적 빠르게 소멸됩니다. 충분한 수의 주입된 배아가 얻어질 때까지 다른 배아에 대해 이 단계를 반복합니다.참고: 배아(주사 및 비주사 모두)의 생존율은 일반적으로 50%-90%입니다. 각 대조군/실험군에 필요한 배아 수의 두 배를 주입하는 것을 목표로 합니다. 비오틴 풀다운 분석에서, 100-140개의 생존 가능한 배아가 각 조건에 대해 요구된다. qRT-PCR 분석에서, 5개의 생존 가능한 배아가 각 조건에 대해 권장된다. 활어 이미징 및 전체 마운트 면역형광 염색 분석을 위한 샘플 크기는 사용자 정의됩니다. 분석에서 좋은 통계적 검정력을 산출하기 위해 조건당 최소 20개의 생존 가능한 배아를 갖는 것이 좋습니다. 주입된 배아를 신선한 10% HBSS 배지가 들어 있는 새로운 10cm 페트리 접시에 헹굽니다.참고: 배아는 물병을 사용하여 홈에서 쉽게 헹굴 수 있습니다. 주입되지 않은 배아를 다른 접시에 모으십시오.참고: 주입되지 않은 배아는 필요에 따라 물고기의 건강, 기준 단백질 발현, 배경 형광 수준 등에 대한 품질 관리 역할을 할 수 있습니다. 주사 절차가 잘 작동하고 주입된 mRNA/모르폴리노가 배아에 치명적이지 않은 경우 주사된 배아와 주입되지 않은 배아는 유사한 생존력을 가져야 합니다. 5. 지렉스 주입된 배아를 실험 설정(즉, 대조군/실험군 수)에 따라 10cm 접시에 분배합니다. 적색광 조명이 있는 어두운 방에서 배지를 1μM Ht-PreHNE(알킨)가 있거나 없는 10% HBSS 30mL로 교체합니다.참고: Ht-PreHNE(알킨)는 가벼운 불안정성 화합물입니다. 배아는 다음 단계에서 어둠 속에 보관해야합니다. 배아를 어둠 속에서 28.5°C에서 배양한다. 30.5hpf의 어두운 방에서 배지를 새 30mL의 10% HBSS로 교체합니다.알림: 매체를 교체할 때 기존 매체를 가능한 한 많이 제거하십시오. 이것은 배아에서 결합되지 않은/과량의 Ht-PreHNE(알킨)를 제거하는 데 중요합니다. 배아를 28.5°C의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 5.4-5.5단계를 두 번 더 반복합니다. UV l을 켭니다amp (365nm, 3mW/cm2) 5분 동안 예열하여 램프를 예열합니다.알림: lamp 예열 단계는 5.8단계 이전에 수행해야 합니다. 난amp 전원을 켠 후 처음 몇 분 동안 더 낮거나 불안정합니다. 램프 전력은 정기적으로 UV 미터로 측정해야 합니다. 32hpf에서 배아를 자외선에 노출시킵니다.옵션 1: 활어 이미징, 전체 마운트 면역형광 염색, 겔 내 형광 분석(Cy5 아지드와 클릭 결합), RNA-seq 또는 qRT-PCR과 같은 다운스트림 판독의 경우 배아를 3분 동안 자외선에 노출시키고 30초마다 플레이트를 소용돌이치게 합니다. 옵션 2: 비오틴 풀다운 분석과 같은 다운스트림 판독의 경우 배아를 최대 5분(최소 3분) 동안 자외선에 노출시키고 30초마다 플레이트를 소용돌이치게 한 다음 플레이트를 얼음에서 1분 동안 냉각합니다.참고: 다른 프로브를 사용하는 경우 주어진 광케이지 친전성 프로브 및 배치된 광원에 대한 광경화의 t1/2에 따라 광 노출 시간을 최적화해야 합니다. t1/2광경화는 공지된 절차(8)를 사용하여 결정될 수 있다. Ht-PreHNE(알킨)의 경우 t 1/2는 < 1분3입니다. 따라서 위에 표시된 시간으로 충분합니다. 6. 다운스트림 분석 옵션 1: 표현형 분석. 형질전환 호중구/대식세포 리포터의 실시간 이미징피라인, Tg(lyz:TagRFP) 및 Tg(mpeg1:eGFP)(그림 2)4°C에서 10분 동안 배양하여 배아를 마취시킨다.참고: 조건당 최소 20개의 생존 가능한 배아를 갖는 것이 좋습니다. 접시에서 수정되지 않은/죽은 배아를 제거합니다.참고: 수정되지 않은/죽은 배아는 흐리거나 투명하지 않으며 육안으로 식별할 수 있습니다. 사망률이 높으면 주사 절차를 다시 확인하거나 mRNA 또는 모르폴리노의 농도를 낮추십시오. 날카로운 집게로 배아를 Dechorionate. 애벌레 물고기를 건드리지 않고 한 쌍의 집게로 chorion을 잡고 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 chorion을 뜯어냅니다. 배아는 연약합니다. chorionation을 수행 할 때만 chorion을 만지십시오.참고: 특히 초보자의 경우 탈모막 중에 일부 배아가 손상되는 것이 일반적입니다. 따라서 항상 필요한 최소값보다 더 많은 배아를 가지십시오. 배아를 2% 아가로스 플레이트(10% HBSS 배지로 준비)에 장착하고 실체현미경(명시야 및 각 형광 채널)으로 배아를 이미지화합니다(그림 2A, C, G).참고: Z-REX[Halo-TeV-Keap1-2xHA mRNA 주입과 Ht-PreHNE(알킨) 처리의 조합] 후, 호중구의 고갈(lyz:TagRFP)은 36hpf(Z-REX 후 4시간)에서 가장 유의한 반면, 대식세포의 감소(mpeg1:eGFP)는 34hpf(Z-REX 후 2시간)에서 가장 유의한 것으로 나타났습니다(그림 2E,F). 다른 리포터 라인, mRNA/모르폴리노 또는 프로브를 사용하는 경우 다른 시점을 사용할 수 있습니다. 노출 시간 및/또는 게인은 단일 세포 또는 원하는 특정(초)구조를 시각화하기 위해 최적화되어야 합니다. ImageJ(NIH)로 각 물고기의 호중구/대식세포 수를 계산합니다(그림 2B, DF, H). ImageJ의 자유형 선택 도구를 사용하여 전체 물고기에 동그라미를 치고 최대값 찾기 옵션을 사용하여 형광 세포의 수를 세십시오. 옵션 2: 타겟 라벨링 평가. 비오틴 아자이드-클릭 커플링 및 비오틴 풀다운 분석(그림 3)4°C에서 배양하여 배아를 마취시킨다. 보통 10분 정도 걸립니다.참고: 충분한 물고기 용해물을 얻으려면 각 조건에 대해 100-140개의 생존 가능한 배아가 필요합니다. 접시에서 수정되지 않은/죽은 배아를 제거합니다. dechorionation 및 deyolking을 수행하십시오. 한 쌍의 날카로운 집게로 융모막을 잡고 다른 쌍의 집게를 사용하여 난황낭을 관통한 다음 융모막을 제거하면서 난황낭을 분리하여 난황 단백질이 나오도록 하여 두 가지 조작을 수행합니다.참고: 이 단계에서 노른자 단백질을 제거하는 것이 중요합니다. 샘플에 풍부한 노른자 단백질은 이후 분석을 방해합니다. 탈노른자 배아를 1.5mL 튜브에 옮깁니다.참고: 플레이트를 소용돌이 제거된 배아의 중앙에 놓으면 수집이 용이합니다. 이 과정에서 더 가벼운 chorion 파편이 사라집니다. 배아가 튜브 바닥에 가라앉은 후 상층액을 제거하고 식힌 HEPES 완충 식염수(pH 7.6) 1mL를 추가합니다. 6.2.5단계를 두 번 더 반복합니다. (선택 사항) 다음 단계를 즉시 진행하지 않으려는 경우 버퍼를 제거하고 샘플을 액체 질소에서 급속 동결한 다음 -80°C에서 보관합니다.알림: 노른자 제거 생선 알갱이는 액체 질소에서 급속 냉동하고 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 급속 냉동 시료는 -80°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다. 용해 완충액에 생선 알갱이를 다시 현탁합니다.참고: 용해 완충액(pH 7.6)은 50mM HEPES, 100mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.3mM TCEP, 2x Roche cOmplete Mini EDTA가 없는 프로테아제 억제제 및 대두에서 추출한 0.1mg/mL 트립신 억제제로 구성됩니다. 한 배아는 약 2 μg의 용해물을 제공합니다. 120개의 배아마다 100μL의 용해 완충액을 사용합니다. 두 가지 Roche cOmplete Mini EDTA-free 프로테아제 억제제와 대두의 트립신 억제제를 사용 직전에 용해 완충액에 첨가해야 합니다. 튜브에 20% v/v 지르코니아 비드를 추가합니다. 20초 동안 소용돌이, 액체 질소에서 플래시 동결, 37°C 수조에서 해동. 6.2.10단계를 두 번 더 반복합니다. 용액을 4°C에서 21,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 미리 냉각된 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다. Bradford assay로 단백질 농도를 측정합니다. 용해물을 1mg/mL로 희석합니다. 각 조건에 대해 170μg의 용해물을 2mL 튜브에 옮깁니다. 6.2.16단계의 용해물을 0.2mg/mL TeV 프로테아제(S219V)와 혼합하고 37°C에서 30분 동안 용액을 배양합니다.참고: TeV를 사용하지 않는 프로테아제 처리 그룹의 경우 용해물을 다른 그룹에서 사용되는 TeV 프로테아제 용액에 동일한 양의 용해 완충액과 혼합하기만 하면 됩니다. 비오틴-아자이드 클릭 반응을 위한 10x 마스터 믹스를 준비합니다: 10% w/v SDS, 10mM CuSO4, 1mM Cu(TBTA), 1mM 비오틴-아지드 및 20mM TCEP.알림: 6.2.19 단계 직전에 믹스에 TCEP를 추가합니다. 8.5 μL의 t-BuOH와 17 μL의 10x 클릭 반응 마스터 믹스를 6.2.17 단계의 (TeV 프로테아제 분해) 용해물에 추가합니다. 와동하고, 원심분리하고, 용액을 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다. 또 다른 1 mM TCEP를 용액에 첨가한 다음, 와동시키고, 원심분리하고, 용액을 37°C에서 15분 동안 추가로 인큐베이션한다. 6.2.19-6.2.20 단계의 배양 시간은 총 30분입니다.참고 : Cu (I)를 생성하기위한 환원 시약 인 TCEP의 보충 교재는 클릭 반응 효율을 향상시킵니다. -20°C 에탄올 600μL를 각 튜브에 넣고 용액을 와동시키고 -80°C에서 밤새 배양합니다.참고: 샘플은 -80°C에서 1주일 동안 보관할 수 있습니다. 그렇지 않은 경우 즉시 다음 단계를 진행하십시오. 용액을 21,000 x g 에서 4°C에서 1시간 동안 원심분리합니다.알림: 원심분리 후 튜브 바닥에 펠릿이 형성되어야 하며, 이는 원하는 분획입니다. 상층액을 제거하고, -20°C의 에탄올 1 mL를 첨가하고, 와동하고, 용액을 4°C에서 21,000 x g 에서 10분 동안 원심분리한다. 6.2.23단계를 반복합니다. 상층액을 제거하고, -20°C의 아세톤 1 mL를 첨가하고, 와동하고, 용액을 4°C에서 21,000 x g 에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거합니다. 과도한 잔류 아세톤이 증발하도록 허용하되 완전히 건조되지는 않습니다. 펠릿을 100μL의 재현탁 완충액(8% w/v 리튬 도데실 설페이트[LDS], 50mM HEPES 식염수 중 1mM EDTA, pH 7.6)에 재현탁하고 15초 동안 소용돌이치고 펠릿이 용해될 때까지 초음파 처리합니다. 용액을 실온(RT)에서 21,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 새로운 2mL 튜브로 옮기고 50mM HEPES 식염수, pH 7.6 1.5mL를 추가합니다.참고: 이 단계에서 LDS의 최종 농도는 0.5%입니다. LDS 농도가 높을수록 풀다운 효율이 저하될 수 있습니다. 따라서, LDS 농도를 증가시키는 것은 비특이적 결합의 감소를 도울 수 있지만, 또한 풀다운의 효율을 감소시킬 수 있다. 따라서 이 단계에서 LDS 농도를 변경하지 않는 것이 좋습니다. “입력” 시료 수집(그림 3): 1mg/mL 용해물 30μL를 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고 6% β-메르캅토에탄올(BME)이 포함된 4x Laemmli 시료 완충액 10μL을 추가합니다. 용액을 급속 동결하고 -80°C에서 보관합니다. 베드 부피 스트렙타비딘 고용량 수지 100μL를 새 2mL 튜브로 옮깁니다. 50mM HEPES 식염수(pH 7.6)에 0.5% LDS 1mL를 넣고 RT에서 1,500 x g 에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 50mM HEPES 식염수(pH 7.6)에 0.5% LDS 1mL를 더 넣어 세척을 반복합니다. 단계 6.2.29의 용액을 단계 6.2.31의 사전 세척된 스트렙타비딘 고용량 수지가 들어 있는 튜브로 옮기고 RT에서 4-6시간 동안 엔드 오버 엔드 믹서에서 용액을 인큐베이션합니다. 혼합물을 RT에서 1,500 x g 에서 2분 동안 원심분리하고, 30 μL의 상청액을 취하고, 10 μL의 4x Laemmli와 혼합합니다.amp”유동” 샘플에 대해 6% BME를 함유하는 버퍼. 그런 다음 나머지 상층액을 제거합니다.참고: “Flowthrough” 샘플은 스트렙타비딘 풀다운 효율을 확인하기 위해 웨스턴 블로팅으로 분석할 수 있습니다. 결합되지 않은 단백질을 씻어내기 위해 가능한 한 많은 상청액을 제거하는 것이 중요합니다. 먼저 P-1000 피펫을 사용하여 대부분의 상층액을 제거한 다음 겔 로딩 팁이 있는 P-20 피펫을 사용하여 나머지 상층액을 제거합니다. 50mM HEPES 식염수(pH 7.6)에 0.5% LDS 1mL를 수지에 첨가하고 혼합물을 RT에서 30분 동안 종단 회전으로 인큐베이션합니다. 혼합물을 RT에서 1,500 x g 에서 2분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거한다.참고: 일반적으로 0.5% LDS는 대부분의 비특이적 결합 단백질을 제거하기에 충분합니다. 이후 분석에서 비특이적 결합 신호가 여전히 나타나는 경우 세척 완충액 내 LDS 농도를 증가시킬 수 있습니다. 6.2.34-6.2.35단계를 두 번 더 반복합니다. 40μL의 2x Laemmli 샘플 버퍼(6% BME가 포함된 버퍼)를 수지에 추가합니다. 혼합물을 98°C에서 5분 동안 인큐베이션하여 결합된 단백질을 용출합니다. 혼합물을 실온에서 21,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 이것은 “용리” 샘플입니다.참고: 6.2.38단계의 수지가 포함된 용액을 겔에 직접 로드하면 SDS-PAGE 분석에 영향을 미칠 수 있습니다. 20 μL를 10-레인 10% 폴리아크릴아미드 겔의 각 웰에 넣고 겔 전기영동을 실행합니다.알림: 더 낮은 볼륨에서 젤을 실행하십시오.tage(120V) 염료 전면이 분해 젤에 도달할 때까지 전압을 170V로 변경합니다. 염료 전면이 나온 후 프로그램을 중지합니다. 하우스키핑 단백질을 검출하는 anti-HA, anti-Halo 또는 기타 항체로 웨스턴 블로팅을 수행합니다(그림 3). 옵션 3: 전사체 분석. RNA-seq 및 qRT-PCR(그림 4)참고: 이 분석을 위해 서로 15분 이내에 놓인 배아를 사용하는 것이 좋습니다. 배아의 연령 차이는 분석 결과에 큰 영향을 미칩니다.Z-REX 후 2시간 동안 4°C에서 10분 동안 배양하여 배아를 마취합니다. 날카로운 집게로 dechorionation을 수행하십시오 (6.1.3 단계). (선택 사항) 서로 다른 세그먼트를 개별적으로 분석해야 하는 경우 집게로 분할(예: 머리와 꼬리 분리)을 수행합니다. 전체 배아에서 RNA를 추출하는 경우 3-5개의 배아를 1.5mL 튜브에 옮깁니다. 머리 또는 꼬리에서 RNA를 추출하는 경우 10-12개의 해부된 세그먼트를 1.5mL 튜브에 옮깁니다.참고: 3-5개의 생물학적 복제물로 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 1mL의 TRIzol 시약과 유리 비드를 튜브에 추가합니다.참고: 유리 구슬은 RNA 추출을 위해 지르코니아 구슬보다 더 잘 작동하는 것으로 밝혀졌습니다. 혼합물을 30 초 동안 소용돌이 치십시오.참고: 다음 단계를 즉시 진행하지 않으면 용액을 -80°C에서 1-3주 동안 보관할 수 있습니다. 제조업체의 지침에 따라 RNA를 추출합니다. 마이크로볼륨 분광광도계 및 아가로스 겔 전기영동으로 RNA 품질 및 농도를 평가합니다.참고: 좋은 품질의 RNA는 약 2.0 이상의 A260/A 280 비율을 가져야 합니다. 염기서열 분석을 위해 RNA를 제출하거나 1μg의 RNA를 증폭 등급 DNase I로 처리하고 위 첨자 III 역전사효소 및 oligo-(dT)20을 사용하여 역전사합니다. 제조업체의 지침에 따라 이 단계를 수행합니다. qRT-PCR을 수행하고, ΔΔCT 방법9에 의해 데이터를 분석한다(도 4B-D). 옵션 4: POI 발현 및 colocalization 분석. 전체 마운트 면역형광 염색 분석법(그림 5)참고: 포름알데히드 고정 배아는 깨지기 쉽습니다. 격렬한 흔들림을 피하고 조심해서 다루십시오.6.1.1-6.1.3 단계에 따라 배아를 탈모합니다. 배아를 1.5mL 튜브로 옮깁니다.참고: 각 튜브에는 동일한 수의 배아가 있어야 하며 40개 이하의 배아가 있어야 합니다. 배아가 튜브 바닥에 가라앉은 후 상층액을 제거하고 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)(pH 7.6)를 추가합니다. 6.4.3단계를 한 번 더 반복합니다. 상층액을 제거하고 PBS(pH 7.6)에 4% 포름알데히드 1mL를 첨가하고 부드럽게 흔들면서 4°C에서 밤새 튜브를 배양합니다.참고: 포름알데히드 용액의 샘플은 4°C에서 1주일 동안 보관할 수 있습니다. 상청액을 제거하고, -20°C 메탄올 1mL를 첨가하고, -20°C에서 적어도 18시간 동안 튜브를 옆으로 눕혀 배양한다.참고: 샘플은 -20°C에서 1개월 이상 보관할 수 있습니다. 상층액을 제거하고 1mL의 PDT 완충액(PBS 완충액에 0.3% v/v Triton X-100, 0.1% v/v Tween-20 및 1% v/v 디메틸 설폭사이드[DMSO])을 추가합니다. 6.4.7 단계를 반복하고 부드럽게 흔들면서 30 분 동안 RT에서 튜브를 배양합니다. 상층액을 제거하고 1mL의 차단 완충액(10% v/v 열 비활성화 태아 소 혈청[FBS], 2% w/v 소 혈청 알부민[BSA] 및 PBS 완충액 중 0.1% v/v Tween-20)을 추가하고 부드럽게 흔들면서 RT에서 1시간 동안 튜브를 배양합니다. 상층액을 제거하고 200 μL의 1차 항체 용액(블로킹 완충액에 희석)을 첨가한다. 상층액을 제거하고 500μL의 1차 항체 용액(블로킹 완충액에 희석됨)을 첨가하고 부드럽게 흔들면서 4°C에서 밤새 튜브를 배양합니다.참고: 새로운 1차 항체를 사용하는 경우 음성 대조군으로 사용하기 위해 1차 항체 염색이 없는 일부 샘플을 포함하는 것이 좋습니다. 그러나, 이상적으로는, 모르폴리노-녹다운 또는 조작된 유전자-녹아웃 배아, 또는 표적 단백질의 발현이 자극된 배아가 항체를 검증하는 보다 신뢰할 수 있는 수단이다. 상층액을 제거하고, 1 mL의 PDT 완충액을 첨가하고, 부드럽게 흔들면서 30 분 동안 RT에서 튜브를 배양한다. 6.4.12단계를 반복합니다. 상층액을 제거하고, 블로킹 완충액 1mL를 첨가하고, 부드럽게 흔들면서 실온에서 1시간 동안 튜브를 배양한다.참고: 샘플은 2차 항체에 접합된 형광단의 광표백을 방지하기 위해 이 단계 후에 빛으로부터 보호되어야 합니다. 상층액을 제거하고 200 μL의 2차 항체 용액(블로킹 완충액에 희석)을 첨가한다. 상층액을 제거하고 500 μL의 2차 항체 용액(블로킹 완충액에 희석됨)을 첨가하고 부드럽게 흔들면서 RT에서 1.5시간 동안 튜브를 배양합니다. 상층액을 제거하고, 1 mL의 PDT 완충액을 첨가하고, 부드럽게 흔들면서 30 분 동안 RT에서 튜브를 배양한다. 6.4.17단계를 반복합니다. 2% 아가로스 플레이트(PBS, pH 7.6으로 제작)에 배아를 장착하고 실체현미경(명시야 및 각 형광 채널)으로 배아를 이미지화합니다(그림 5A,B,D,F).참고: 라이카 M165 FC 형광 실체현미경을 사용하는 경우 25배의 배율을 사용하여 좋은 해상도의 이미지를 얻을 수 있습니다. ImageJ(NIH)로 형광 신호 강도를 정량화/분석합니다. ImageJ의 [자유형 선택 ] 툴을 사용하여 관심 영역의 신호를 수량화할 수 있습니다.