난소 절제된 마우스 모델에서 임신 확립에 대한 자궁 기여도를 연구하는 방법
Summary
임신 확립은 복잡한 배아와 자궁 누화를 포함하는 역동적인 과정입니다. 이러한 과정에 대한 산모의 자궁 환경의 정확한 기여는 여전히 활발한 조사 영역으로 남아 있습니다. 여기에서는 이러한 연구 질문을 해결하기 위해 생체 내 동물 모델을 설계하는 데 도움이 되는 자세한 프로토콜이 제공됩니다.
Abstract
임신이 성립되려면 생존 가능한 배반포가 수용성 자궁 내막(자궁내막)과 성공적으로 상호 작용하여 착상 및 태반 형성을 촉진하고 지속적인 임신을 가능하게 해야 합니다. 배아 결함으로 인한 임신 성공의 한계는 잘 알려져 있으며 최근 수십 년 동안 체외 수정(IVF) 및 보조 생식 기술의 등장으로 크게 극복되었습니다. 그러나 아직까지 이 분야는 부적절하게 수용되는 자궁내막으로 인한 한계를 극복하지 못하여 IVF 성공률이 정체되었습니다. 난소와 자궁내막 기능은 밀접하게 얽혀 있는데, 난소에서 생성되는 호르몬이 자궁내막의 월경 주기를 담당하기 때문입니다. 따라서 설치류 임신 모델을 사용할 때 관찰 된 결과가 난소 또는 자궁 결손으로 인한 것인지 확인하기 어려울 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 배아 이식 또는 인공 탈락술을 통해 난소 절제술 마우스 모델을 개발하여 임신에 대한 자궁 특이적 기여도를 연구할 수 있도록 했습니다. 이 기사는 난소 절제술을 수행하는 방법에 대한 지침을 제공하고 건강한 기증자로부터 배아 이식 후 성공적인 인공 탈락 또는 임신을 지원하기 위해 외인성 호르몬을 공급하는 다양한 기술에 대한 통찰력을 제공합니다. 이러한 기술에는 피하 주사, 서방성 펠릿 및 삼투압 미니 펌프가 포함됩니다. 각 방법의 주요 장점과 단점에 대해 논의하여 연구자가 특정 연구 질문에 가장 적합한 연구 설계를 선택할 수 있도록 합니다.
Introduction
최근 수십 년 동안 보조 생식 기술의 사용이 증가함에 따라 임신에 대한 많은 장벽이 극복되어 많은 부부가 불임 문제에도 불구하고 가정을 꾸릴 수 있게 되었습니다1. 난모세포 또는 정자 결손은 종종 체외 수정 또는 세포질 내 정자 주입을 사용하여 우회할 수 있습니다. 그러나 자궁 및 자궁내막 수용성과 관련된 문제는 생식 가능성의 파악하기 어려운 “블랙박스”로 남아 있다2.
임신은 고품질 배아가 수용성 자궁 내막 (자궁 내막)과 성공적으로 상호 작용할 때 확립됩니다. 월경 주기에 임신이 성공할 확률은 약 30%로 낮습니다.3,4. 임신 성공 사례 중 임신 20주가 지난 임신의 경우 50%-60%만이 진행되며, 임신 20주가 지나지 않은 임신의 75%는 착상 실패로 인해 발생한다3. 1990년대 후반으로 거슬러 올라가는 이러한 수치에도 불구하고 이 분야는 아직 부적절하게 수용되는 자궁내막으로 인한 한계를 극복하지 못했습니다. 이로 인해 최근 몇 년 동안 IVF 성공률이 정체되고 때로는 감소했습니다 5,6.
설명할 수 없는 불임이 있는 여성은 종종 수용성 창이 변위되거나 알 수 없는 이유로 수용성을 달성할 수 없습니다. 최근에, 자궁내막 수용성 어레이가 개발되었는데, 이는 배아 이식 시기를 개인의 수용성 창에 맞추기 위한 목적으로 수백 개의 유전자의 발현을 평가한다 7,8,9. 그러나 이 분야는 착상 과정이 완료된 후 나타나는 임신 합병증의 발병기전에 대한 이해가 여전히 부족합니다.
여성 생식 기관은 매우 역동적이며 엄격한 호르몬 조절하에 있습니다. 시상하부-뇌하수체-생식선(HPG) 축은 난포 성숙, 에스트로겐 및 프로게스테론 활성을 포함한 난소 주기의 측면을 조절하는 황체 형성 호르몬과 난포 자극 호르몬의 방출을 조절합니다. 차례로, 자궁 생리주기는 에스트로겐과 프로게스테론10,11에 의해 조절됩니다. 따라서 자궁 생물학적 기전을 연구하는 것은 난소의 영향으로 복잡합니다. 예를 들어, 암 치료가 자궁에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 연구할 때 관찰된 자궁 표현형(예: 임신 손실 또는 월경 무주기성)이 자궁에 대한 직접적인 손상의 결과인지 또는 난소 손상으로 인한 결과인지 구별하기 어려울 수 있습니다.
생식력을 종합적으로 이해하려면 임신에 대한 자궁 기여도를 특성화해야 합니다. 중요한 것은 이러한 이해가 난소 통제 하에서 자궁 기능을 넘어 확장되어야 한다는 것입니다. 이것은 인간에게서 연구 할 수 없습니다. 따라서 동물 모델이 자주 사용됩니다. 따라서 난소 절제술(OVX)은 일반적으로 연구자들이 호르몬을 외인성으로 공급하여 설치류 발정 주기(월경 주기와 유사)를 조절할 수 있도록 하는 데 사용됩니다. 또한, OVX는 난소 영향과 독립적으로 자궁 반응을 연구할 수 있도록 한다12. 그러나 OVX 후 호르몬이 즉시 공급되지 않으면 결국 폐경 표현형이 발생하므로 연구자들이 신중하게 고려해야 합니다.
OVX는 설치류 모델 13,14,15,16,17에서 자주 사용되며 적절한 훈련 후에 수행하기가 비교적 쉽습니다. 방법은 난소 단독 또는 난소와 난관이 제거되었는지 여부와 동물의 나이에 따라 다릅니다 (성인, 순환 동물은 표면에 황체가 보이는 더 큰 난소를 가지고 있으므로 난소를 시각화하기가 더 쉽습니다). 이와 유사하게, 호르몬 보충 방법에는 피하 주사14, 서방성 펠릿 15, 삼투압 미니 펌프18, 난소 이식술 등 여러 가지가 있다.
이 기사에서는 난소 절제술을 수행하고 피하 주사, 서방성 펠릿 및 삼투압 미니 펌프를 포함한 세 가지 유형의 호르몬 보충제를 준비하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다. OVX에 이어 외인성 호르몬 보충(배아 이식 및 인공 탈락)의 이점을 얻는 실험적 종점에 대해 두 가지 세부 프로토콜이 제공됩니다. 이 기사에서는 특히 임신 및 불임 연구 분야에서 자궁에 미치는 영향을 분리하기 위한 연구를 수행하는 방법에 대해 연구자를 안내하는 것을 목표로 각 접근 방식의 강점과 약점에 대해 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사는 OVX를 수행하고 임신과 생식력에 대한 자궁의 기여도를 이해하는 데 중점을 둔 연구를 위해 외인성 호르몬을 제공하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 배아 이식을 수행하고 인위적으로 탈락을 유도하는 것을 포함하여 이러한 방법의 두 가지 실험적 적용에 대해 두 가지 세부 프로토콜이 제공됩니다.
OVX를 수행하는 것은 처음에는 어려울 수 있지만, 특히 설…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원과 호주 정부 NHMRC(National Health and Medical Research Council) IRIISS를 통해 가능했습니다. 이 작업은 Monash Reproductive Services Platform에 액세스하기 위해 A.L.W. (Winship-PAG18-0343)에 대한 Monash University 의학, 간호 및 건강 과학 플랫폼 액세스 보조금의 지원을 받았습니다. ALW는 ARC(Australian Research Council)의 DECRA 자금 지원 DE21010037의 지원을 받습니다. JNH와 LRA는 호주 정부 연구 훈련 프로그램 장학금의 지원을 받습니다. L.R.A.는 Monash Graduate Excellence Scholarship의 지원을 받습니다. KJH는 ARC Future Fellowship FT190100265의 지원을 받습니다.
Materials
| ALZET 1002 mini osmotic pumps | BioScientifica | 1002 | Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure – Embryo transfer). |
| ALZET 1003D mini osmotic pumps | BioScientifica | 1003D | Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure – Artificial decidualization). |
| ALZET Reflex 7 mm clips | BioScientifica | 0009971 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip applicator | BioScientifica | 0009974 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip remover | BioScientifica | 0009976 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| Bupivicaine injection | Pfizer | NA | Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline |
| Estradiol | Sigma | E8875 | |
| Meloxicam | Ilium | NA | Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 200 mL cage bottle, or as your institutions vet prescribes. |
| Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
| Multi purpose sealant | Dow Corning | 732 | |
| Non-surgical embryo transfer (NSET) device | ParaTechs | 60010 | Contains 6 mm speculum. Single use only. |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Soluble in ethanol. Use for section 3 (Hormone preparation – subcutaneous injection) and section 4 (Hormone preparation – slow-release pellets) |
| Progesterone | Sigma | P7556 | Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation – osmotic mini pumps) |
| Refresh eye ointment | Allergan | NA | 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin |
| Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | Stock 50 mg/mL. Use at 5 mg/kg |
| Rubber tubing | Dow Corning | 508-008 | Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ± 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm. |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | |
| Sofsilk Silk sutures size 3-0 | Covidien | GS-832 |
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