In vitro Studio degli effetti della matrice extracellulare ricca di ialuronana sulla migrazione delle cellule della cresta neurale
Summary
Questo protocollo delinea un esperimento di migrazione in vitro adatto all’analisi funzionale delle molecole coinvolte nella migrazione in vivo delle cellule della cresta neurale nella matrice extracellulare ricca di ialuronano.
Abstract
Le cellule della cresta neurale (NCC) sono cellule altamente migratorie che provengono dalla regione dorsale del tubo neurale. L’emigrazione di NCC dal tubo neurale è un processo essenziale per la produzione di NCC e la loro successiva migrazione verso siti bersaglio. La via migratoria delle NCC, compresi i tessuti del tubo neurale circostante, coinvolge la matrice extracellulare ricca di acido ialuronico (HA). Per modellare la migrazione NCC in questi tessuti circostanti ricchi di HA dal tubo neurale, in questo studio è stato stabilito un saggio di migrazione del substrato misto costituito da HA (peso molecolare medio: 1.200-1.400 kDa) e collagene di tipo I (Col1). Questo test di migrazione dimostra che le cellule della linea cellulare NCC, O9-1, sono altamente migratorie sul substrato misto e che il rivestimento HA è degradato nel sito di aderenze focali nel corso della migrazione. Questo modello in vitro può essere utile per un’ulteriore esplorazione delle basi meccanicistiche coinvolte nella migrazione NCC. Questo protocollo è applicabile anche per valutare diversi substrati come scaffold per studiare la migrazione NCC.
Introduction
Le cellule della cresta neurale (NCC) sono una popolazione cellulare multipotente presente negli embrioni in via di sviluppo e provengono dal bordo della piastra neurale durante la neurulazione. Contribuiscono alla formazione di una varietà di tessuti, tra cui il sistema nervoso periferico, il sistema cardiovascolare, i tessuti craniofacciali e lo scheletro1. Dopo l’induzione e la specifica NCC al bordo della piastra neurale, gli NCC emigrano dal neuroepitelio e migrano verso i siti tissutali derivati da NCC1.
L’acido ialuronico (HA) è un glicosaminoglicano non solfato distribuito in una varietà di tessuti come componente della matrice extracellulare (ECM). L’importanza dell’HA nello sviluppo embrionale è stata dimostrata in sistemi modello attraverso l’ablazione di geni responsabili del metabolismo ialuronico. Ad esempio, le mutazioni nei geni della sinalunosi ialuronica (Has1 e Has2) in Xenopus sono state trovate per portare a difetti di migrazione NCC e malformazione craniofacciale2. Inoltre, è stato riportato che i proteoglicani leganti l’HA, aggrecan e versican, esercitano effetti inibitori sulla migrazione degli NCC3. Nei topi, l’ablazione Has2 porta a gravi difetti nella formazione del cuscino endocardico, con conseguente letalità a metà gestazione (E9.5-10) 4,5,6.
La proteina transmembrana 2 (Tmem2), una ialuronidasi della superficie cellulare, ha recentemente dimostrato di svolgere un ruolo critico nel promuovere l’adesione e la migrazione delle cellule tumorali mediate da integrina rimuovendo l’HA associato alla matrice nei siti di adesione 7,8. Più recentemente, Inubushi et al.9 hanno dimostrato che una carenza di Tmem2 porta a gravi difetti craniofacciali dovuti ad anomalie nell’emigrazione/migrazione e sopravvivenza delle NCC. Nel precedente studio9, l’espressione di Tmem2 è stata analizzata durante la formazione e la migrazione di NCC. L’espressione di Tmem2 è stata osservata nel sito di delaminazione delle NCC e nelle NCC Sox9-positive emigrate (Figura 1). Inoltre, utilizzando cellule della cresta neurale O9-1 di topo impoverite di Tmem2, lo studio ha dimostrato che l’espressione in vitro di Tmem2 era essenziale per le cellule O9-1 per formare aderenze focali e per la loro migrazione in substrati contenenti HA (Figura 2 e Figura 3)9.
Questi risultati indicano fortemente che Tmem2 è importante anche per l’adesione e la migrazione di NCC attraverso l’ECM ricco di HA. Tuttavia, il meccanismo molecolare di adesione e migrazione degli NCC all’interno della ECM ricca di HA non è ancora chiaro. È quindi necessario stabilire un sistema sperimentale di coltura in vitro per esplorare appieno l’adesione e la migrazione di NCC all’interno dell’ECM ricco di HA.
Tra i numerosi approcci impiegati nel testare la migrazione cellulare, il test basato sulla chiusura della ferita cellulare è un metodo semplice frequentemente utilizzato nei campi della fisiologia e dell’oncologia10. Questo approccio è utile per la sua rilevanza per il fenotipo in vivo ed è efficace nel determinare i ruoli di farmaci e chemioattrattanti durante la migrazione cellulare11. È possibile valutare la capacità di migrazione sia delle masse cellulari intere che delle singole cellule misurando le distanze del gap cellulare nel tempo11. In questo manoscritto, viene introdotto un saggio modificato in vitro basato sulla chiusura della ferita per modellare la migrazione NCC nei tessuti ricchi di HA che circondano il tubo neurale. Questa procedura è applicabile anche per lo studio di diversi componenti della ECM (cioè collagene, fibronectina e laminina) per analizzare il ruolo dello scaffold ECM nella migrazione NCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diverse componenti dell’ECM regolano l’emigrazione/migrazione dei NCC. Ad esempio, l’HA regola positivamente la migrazione NCC 2,15. È interessante notare che uno studio basato su modelli genetici murini di Tmem2, una ialuronidasi della superficie cellulare, ha chiarito il requisito della degradazione dell’HA nella migrazione NCC9. I collageni sono anche abbondanti nella ECM che circonda il tubo neurale16. Decorin,…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esprimo grande gratitudine a Fumitoshi Irie e Yu Yamaguchi per il loro incoraggiamento e i gentili suggerimenti nello stabilire questo metodo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni in aiuto per programmi di ricerca scientifica dalla Japan Society for the Promotion of Science (#19KK0232 a T.I., #20H03896 a T.I.). Il metodo originale per il rivestimento di HA su substrati di vetro e saggi di degradazione dell’HA in situ sui substrati è stato descritto in Yamamoto et al. (2017) 8, mentre il metodo per la preparazione di substrati misti HA / Col1 è stato descritto in Irie et al. (2021) 7.
Materials
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
Referenzen
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Entwicklungsbiologie. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
