Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope(2광자 현미경을 사용한 폐쇄 두개골 외상성 뇌 손상 및 두개골 창이 있는 마우스의 형광 단백질 발현의 생체 내 이미징)

스포츠 부상, 차량 충돌 및 군사 전투로 인해 발생할 수 있는 외상성 뇌 손상(TBI)은 전 세계적으로 건강 문제입니다. TBI는 생리적, 인지적, 행동적 결핍과 평생 장애 또는 사망률로 이어질 수 있다 ^1,2. TBI 중증도는 경증, 중등도 및 중증으로 분류할 수 있으며, 대다수는 경증 TBI(75%-90%)³입니다. TBI, 특히 TBI의 반복적인 발생은 신경 퇴화를 촉진하고 알츠하이머병(AD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전두측두엽 치매(FTD) 및 만성 외상성 뇌병증(CTE)을 포함한 여러 신경 퇴행성 질환의 위험 요인으로 작용할 수 있다는 사실이 점점 더 많이 인식되고 있습니다.^4,5,6. 그러나 TBI 유발 신경 퇴행의 기저에 있는 분자 메커니즘은 여전히 불분명하므로 활발한 연구 분야입니다. 뉴런이 TBI에 반응하고 TBI로부터 회복하는 방법에 대한 통찰력을 얻기 위해, TBI 후 마우스에서 종방향 생체 내 이미징에 의해 특히 뉴런 내에서 관심 있는 형광 태그 단백질을 모니터링하는 방법이 본원에 설명되어 있습니다.

이를 위해 본 연구는 이전에 보고된 것과 유사한 폐쇄형 두개골 TBI 투여를 위한 외과적 절차(^7,8)와 Goldey 등⁽9)이 기술한 바와 같이 다운스트림 생체 내 이미징을 위한 두개골 창 이식을 위한 외과적 절차를 결합하는 방법을 보여줍니다. 특히, TBI를 유도하는 체중 감소의 영향으로 창호가 손상되고 마우스에 돌이킬 수 없는 손상을 입힐 가능성이 높기 때문에 두개골 창을 먼저 이식한 후 동일한 부위에 TBI를 수행하는 것은 불가능합니다. 따라서 이 프로토콜은 TBI를 투여한 다음 동일한 수술 세션 내에서 충격 부위 바로 위에 두개골 창을 이식하도록 설계되었습니다. 한 번의 수술 세션에서 TBI와 두개골 창 이식을 결합하는 것의 장점은 마우스가 수술을 받는 횟수를 줄일 수 있다는 것입니다. 또한 TBI에 대한 즉각적인 반응(즉, 시간 척도)을 모니터링할 수 있으며, 이후 수술 세션(즉, TBI 후 며칠 동안 초기 이미징을 시작하는 것)에서 창을 이식하는 것과는 대조적입니다. 두개골 창 및 생체 내 이미징 플랫폼은 또한 고정 조직의 면역 염색과 같은 기존 방법으로 신경 단백질을 모니터링하는 것보다 이점을 제공합니다. 예를 들어, 개별 시점에 필요한 별도의 마우스 코호트와 달리 동일한 마우스를 여러 시점에서 연구할 수 있기 때문에 생체 내 이미징에 더 적은 수의 마우스가 필요합니다. 또한 시간이 지남에 따라 동일한 뉴런을 모니터링할 수 있으므로 동일한 세포 내에서 특정 생물학적 또는 병리학적 사건을 추적할 수 있습니다.

개념 증명으로서, 시냅신 프로모터 하에서 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)의 뉴런 특이적 발현이 여기¹⁰에 입증되어 있다. 이 접근법은 1) 희소돌기아교세포에 대한 미엘린 염기성 단백질(MBP) 프로모터 및 성상교세포에 대한 신경교세포의 섬유산성 단백질(GFAP) 프로모터와 같은 다른 세포 유형 특이적 프로모터를 활용하여 다른 뇌세포 유형으로 확장할 수 있으며, 2) 유전자를 EGFP 유전자와 융합하여 관심 있는 다른 표적 단백질을 활용^{하고, 3}) 서로 다른 형광단에 융합된 여러 단백질을 동시 발현할 수 있습니다. 여기서 EGFP는 두개내 주사를 통한 아데노 관련 바이러스(AAV) 전달을 통해 패키징되고 발현됩니다. 폐쇄형 두개골 TBI는 체중 감량 장치를 사용하여 투여된 후 두개골 창을 이식합니다. 신경 세포 EGFP의 시각화는 두개골 창을 통해 이루어지며, 생체 내에서 EGFP 형광을 검출하기 위해 이광자 현미경을 사용합니다. 2광자 레이저를 사용하면 광손상을 최소화하면서 피질 조직 깊숙이 침투할 수 있어 며칠 및 최대 12,13,14,15개월 동안 개별 마우스 내에서 동일한 피질 영역의 반복적인 세로 이미징이 가능합니다. 요컨대, TBI 수술과 생체 내 영상을 결합하는 이러한 접근법은 TBI 유발 질환 병리학에 기여하는 분자 사건에 대한 이해를 증진시키는 것을 목표로 한다^16,17.