功能性破骨细胞与人外周血CD14⁺ 单核细胞的鉴别

从苏格兰国家输血服务局（爱丁堡）获得的白细胞外套和从NHS血液和移植（纽卡斯尔）获得的白细胞锥以完全匿名（不可识别）的形式提供给格拉斯哥大学的研究人员，来自完全同意的NHS献血者。血沉棕黄层和白细胞锥形血液成分由苏格兰或英格兰的NHS献血中心提供的NHS标准献血产生。献血者在献血时对标准NHS临床实践中未使用的剩余血液给予知情同意，以用于批准的医学研究。NHS研究伦理委员会的伦理批准和签署的使用这些献血的捐赠者同意书由NHS献血服务机构持有。使用国家输血服务（苏格兰）和NHS血液和运输（英格兰）的标准内部申请和审查流程，寻求并获得了在批准的医学研究中访问和使用这些同意的献血的批准。不需要进一步的NHS REC批准或格拉斯哥大学内部伦理委员会的批准即可将血液成分用于批准的医学研究。 1. 开始前的一般注意事项 谨慎地进行所有血液工作。考虑样品中可能存在的各种传染因子的潜在危害。 在无菌条件下，在生物安全实验室中谨慎地进行所有工作，同时戴上手套和实验室外套。 根据当地指南进行生物安全处置。 根据地方当局的规定，在采集样本之前获得适当的同意和道德批准。 一般来说，1mL新鲜血液会产生100万个PBMC，CD14+单核细胞约占PBMC的10%-30%。相比之下，10 mL 的白细胞锥体可以包含 5 x 10 8-15 x 108 PBMC。有关 PBMC 隔离的更多详细信息，请参阅之前的协议37。 2. 从全血中分离外周血单核细胞（PBMC） 从健康供体收集所需体积的新鲜血液到锂肝素收集管中。注意：也可以使用其他带有适当抗凝剂的收集管（例如，肝素钠管）。对于更高的细胞计数，可以使用白细胞锥或血沉棕黄层。 要分离 PBMC，请将血液转移到新的 50 mL 管中，并分别用无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 以 1：1 或 1：3 的比例稀释新鲜血液或白细胞锥体/血沉棕黄层。 通过倒置轻轻混合细胞几次。 准备含有 3 mL 密度梯度培养基的 15 mL 管。将8-10mL稀释的血液缓慢地分层在密度梯度培养基的顶部，并在室温（RT）下以400× g 离心30分钟，无需制动。注意：将血液小心地涂抹在密度梯度介质的顶部，以防止混合。混合可能会导致PBMC的损失。 用巴斯德移液管小心地丢弃顶层（含有血浆），收集含有PBMC（白色环状结构）的下层界面层，并将该层转移到新的50 mL管中。 用无菌 1x PBS 悬浮细胞高达 50 mL，并通过在室温下以 300 x g 离心 10 分钟并完全制动来洗去残留的密度梯度培养基。 为了去除残留的血小板，在没有制动器的情况下，在室温下以200× g 的额外较慢旋转10分钟重复该过程。 可选：要去除红细胞残留物，请在蒸馏水中以 1：10 的比例稀释红细胞裂解缓冲液（10x， 材料表），然后将 3 mL 稀释的缓冲液涂在沉淀上。混合，孵育3分钟。在多达 50 mL 的 1x PBS 中洗涤沉淀，并在室温下以 300 x g 离心 10 分钟，并带全制动器。 将分离和纯化的PBMC重悬于20 mL的1x PBS中，并使用血细胞计数器或遵循其他标准方法进行计数。注意：细胞稀释和细胞计数方法必须根据所使用的细胞密度和计数设备进行相应的调整。 3. 富集来自PBMC的CD14+ 单核细胞 根据制造商的方案（材料表），使用人CD14 +选择试剂盒从PBMC中分离CD14 +单核细胞。注意：经典CD14 + CD16− 单核细胞是OC前体35的主要来源;可以考虑其他纯化方法。 将 1 x 107 PBMC 转移到合适的聚苯乙烯圆底管（即适合选择套件磁铁）中，并以 300 x g 将细胞沉淀 5 分钟。 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于细胞分离缓冲液（PBS、2% 胎牛血清 [FBS]、1 mM 乙二胺四乙酸 [EDTA]）中至终浓度为 1 x 108 个细胞/mL，并在盖上盖子的情况下与每 100 μL 10 μL 抗体混合物孵育 10 分钟。注意：细胞以 1 x 108 个细胞/mL 重悬;相应地调整音量。 孵育后，每 100 μL 加入 10 μL 磁性纳米颗粒珠，并在盖上盖子的情况下孵育 3 分钟。注意：调整抗体混合物和磁珠的体积以获得 10 μL/mL 的浓度。 用细胞分离缓冲液将体积加满至2.5 mL，将试管放入磁铁（不带盖子）中，孵育3分钟。当管仍在磁铁中时，通过反转连续移动丢弃阴细胞群。注意：如果使用 >2 x 108 PBMC 和更大的磁体，请按照制造商的说明使用细胞分离缓冲液加满 5 mL 或 10 mL。 从磁铁上取下试管，并通过将它们重悬于2.5mL细胞分离缓冲液中来洗涤附着在磁珠上的富集CD14 + 单核细胞。像以前一样在磁铁内孵育3分钟，丢弃负部分，然后再次重复一次。 将所有收集的细胞以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于 5 mL α 最小必需培养基 （α-MEM; 目录）补充 1% L-谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素（完全 α-MEM）和 10% FBS。注意：建议通过流式细胞术 进行 富集后纯度检查，预期纯度应为≥96%。额外的洗涤步骤（步骤3.6）可以提高纯度。 4. 体外OC分化 使用血细胞计数器计数富集的CD14 + 单核细胞。 以 300 x g 沉淀细胞 5 分钟，并在补充有 10% FBS 的完整 α-MEM 中以 1 x 106 个细胞 /mL 重悬。 为了区分OC，将终浓度为25ng / mL的M-CSF添加到细胞悬液中。注意：对于 1 mL 细胞悬液，从 100 μg/mL 的储备浓度中加入 0.25 μL M-CSF。 通过彻底移液混合以均质化细胞悬液，并在平底 96 孔板中板 100 μL/孔，最终细胞密度为 1 x 105 个细胞/孔。 将 200 μL/孔无菌蒸馏水添加到铺板细胞周围的孔中，以防止培养基蒸发和培养系统中的边缘效应。 将细胞在37°C下用5%CO2孵育过夜约18-20小时。 孵育过夜后，使用 P200 移液管通过抽吸小心地去除一半的培养基（50 μL/孔），避免接触孔底部，并用含有 10% FBS、25 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL 的新鲜温热的完整 α-MEM 替换，最终浓度为 25 ng/mL注意：对于 1 mL 培养基，从 100 μg/mL 的储备浓度中加入 0.25 μL M-CSF 和 0.5 μL RANKL。 每3天更换一次培养基，并将细胞分化为OC7-14天（图1）。注意：在整个培养过程中保持M-CSF和RANKL浓度一致。 图 1：OC 差异化工作流程。 从PBMC中分离CD14 + 单核细胞并在M-CSF和RANKL存在下分化为成熟OC的示意图概述7-14天。RT = 室温。使用 BioRender.com 创建的图像。 请点击此处查看此图的大图。 5. 破骨细胞的陷阱染色 小心地除去培养基，用100μL/孔的先前制备的固定溶液固定分化的贴壁OC，并孵育1分钟。不要触摸孔的底部，以免划伤贴壁细胞。注意：固定剂溶液的制备方法如下：12.5 mL 柠檬酸盐溶液（包含在 TRAP 染色试剂盒中）、32.5 mL 丙酮和 5 mL 37% 甲醛。 用 300 μL 无菌蒸馏水洗涤孔三次。清洗后将盘子拍干。 根据制造商的说明（材料表）制备染色溶液;加入 5 μL 快速石榴石和 5 μL 亚硝酸钠制成快速石榴石溶液;倒置混合，并在室温下孵育 3 分钟。 通过混合 900 μL 无菌蒸馏水、10 μL 萘酚、40 μL 乙酸盐溶液、50 μL 酒石酸盐溶液和 10 μL 快速石榴石溶液制备 1 mL 染色溶液。 加入100μL /孔新鲜制备的染色溶液，并将板在37°C下在黑暗中孵育20分钟。 孵育后，倒置除去染色溶液，并用300μL/孔蒸馏水洗涤板三次。 通过在纸巾上敲击盘子来去除多余的水。将板打开并避光干燥过夜。注意：干燥板最多可以保存 6 个月。有时，残留的缓冲液可以促进霉菌的发展，在显微镜下可见;这可以通过用蒸馏水清洗受影响的井并让它们再次风干来随时去除。 使用带有平铺选项的明场显微镜以 10x 或 20x 拍摄图像，以捕获整个孔表面。 使用带有细胞计数器插件的图像分析软件手动计数具有三个以上细胞核的 TRAP+ 紫色染色细胞的 OC。注意：每孔的TRAP+ OC数量取决于供体，可能在~200-1，600 OC /孔之间变化，平均约为1，000 OC /孔。此外，为了分析数据，应在三个不同的孔中确定OC数（技术重复），并应计算每个条件和每个生物重复的平均值。 6. 骨吸收试验 将新鲜富集的CD14 +单核细胞铺在涂有磷酸钙的96孔骨测定板上，以1 x 105 个细胞/孔，并分化OC7-14天，如步骤4.1-4.8所示，并每3天更换一次培养基。注意：牙本质/象牙或牛皮质骨切片可用于代替骨测定板。如果是这样，由于要再吸收更复杂的底物，培养的总时间应延长至14-21天。 在结束时间点，小心地除去培养基，避免接触孔底，并用10%次氯酸钠溶液裂解细胞。用蒸馏水清洗孔三次。 使用明场显微镜扫描干燥板，并使用图像分析软件分析/量化吸收坑的采集图像。 7.肌动蛋白环荧光染色 在 18 孔室载玻片中以 1 x 105 个细胞 /孔的细胞密度将 100 μL/孔的分离的 CD14+ 单核细胞板 100 μL/孔。如前所述（步骤4.1-4.8），在存在M-CSF和RANKL的情况下区分OC，包括每3天更换一次培养基。 在结束时间点，轻轻除去培养基，并用 200 μL/孔预热的 PBS（pH 7.4）洗涤每个孔两次。不要让井在任何步骤之间干涸。 用 100 μL/孔的 4% 甲醛溶液在 PBS 中固定样品，并在室温下在轨道振荡器上轻轻摇动孵育 10 分钟。注意：甲醇会在固定过程中破坏肌动蛋白。因此，最好避免使用任何含甲醇的固定剂。优选的固定剂是无甲醇甲醛。协议这一步中使用的轨道振动台的功率设置为10分中的3分。 用 200 μL/孔的 PBS 洗涤两次，用 100 μL/孔的 0.1% Triton X-100 溶液在 PBS 中稀释透化细胞，并在室温下在轨道振荡器上轻轻摇动孵育 10 分钟。 用 200 μL/孔的 PBS 洗涤两次。要阻断非特异性结合并增加信号，请加入 100 μL/孔由 2% 牛血清白蛋白 （BSA）/PBS 溶液制成的封闭溶液。在室温下在轨道振荡器上轻轻摇动孵育20分钟。 取出封闭溶液，加入 100 μL/孔的荧光共轭鬼笔环肽溶液，稀释在 2% BSA/PBS 溶液中。在室温下在轨道摇床上孵育20分钟，轻轻摇动并避光。注意：根据制造商的建议调整鬼笔环肽染料的浓度。 用 200 μL/孔的 PBS 洗涤两次，用 100 μL/孔的含有 300 nM DAPI 的 PBS 溶液染色细胞核，并在室温下在轨道振荡器上温育 10-15 分钟，轻轻摇动并避光。注意：将DAPI在蒸馏水中稀释，制成14.3 mM（5 mg / mL）DAPI储备溶液。将储备溶液进一步稀释至终浓度300μM。最后，将300μM DAPI溶液在PBS中再次稀释一次至终浓度为300nM。 10-15分钟后，取出DAPI溶液，并用100μL/孔PBS替换。注意：根据所选的腔室载玻片，使用适当体积的PBS（18孔腔室载玻片为100μL/孔）储存，或使用盖玻片和适当的安装介质安装载玻片。腔室载玻片可以在冰箱中存放长达 1 周。对于 18 孔室载玻片，使用 50-100 μL 染色体积和 200-300 μL 进行洗涤。相应地放大到其他腔室载玻片尺寸。为避免蒸发，在孵育期间将盖玻片放在有盖的容器内。建议使用轨道振动台，但不是必需的。 使用适当的免疫荧光或共聚焦显微镜和4倍至40倍的放大倍数可视化染色。 8. 通过流式细胞术分选 富 集成熟OC和OC前体 将新鲜富集的CD14 + 单核细胞重悬于1 x 106 个细胞/mL，并在M-CSF和RANKL存在下以与上述相同的方式将它们分化为成熟的OC（步骤4.1-4.8）。注意：从96孔板放大到更大的板尺寸时，请遵循 表1;这些体积从 1 x 106 个细胞/mL 溶液开始计算，并为细胞间融合提供最佳密度。 在第 7 天，用温热的 PBS 洗涤孔一次，并向 1 mL（体积由所用板尺寸决定）的 accutase 中加入 50 μL。将细胞在37°C下用5%CO2 孵育20分钟。 孵育后，在光学显微镜下检查平板，看看细胞是否已分离。此外，通过敲击所有侧面的板并上下移液来分离细胞。 将细胞悬液收集在 15 mL 锥形管中。用温热的PBS（无钙2+，无镁2+）洗涤孔，并将它们与细胞悬液结合。重复步骤8.2-8.3一次或两次，直到大多数细胞分离。注意：Accutase是流式细胞术分析表面染色前的推荐方法，不会分离非常大的OC。回收率为~50%-70%。 将细胞以 300 x g 离心 5 分钟，将细胞沉淀重悬于 1 mL PBS 中，并通过台盼蓝排除对细胞进行计数。 以 1 x 106 个细胞/mL 重悬细胞，取出对应于 1 x 105 个细胞的 100 μL，并将这些细胞转移到新的聚丙烯试管中。加入 200 μL 细胞分选缓冲液，并将其放在冰上作为未染色的对照。 用活/死染料在室温下以1：750稀释10分钟并避光染色其余细胞。注意：活/死染色需要在没有FBS的情况下进行，以避免高背景染色。 用温热的细胞分选缓冲液（1x PBS，无钙2+，无Mg2+，1S和5mM EDTA）填充含有活/死染色细胞悬液的15 mL收集管，并以300 x g 离心5分钟以沉淀细胞。注意：建议在分选缓冲液中使用高浓度的EDTA和低浓度的FBS，以防止细胞团块。 取出对应于1 x 105 细胞的体积，并将它们转移到新的聚丙烯试管中进行OSCAR同种型对照。将所有剩余的细胞转移到另一个聚丙烯试管中进行染色和细胞分选。注意：聚丙烯试管用于分选，因为细胞比聚苯乙烯管更不可能粘附在这些试管上。 以400× g 离心管5分钟以沉淀细胞，并通过倒置丢弃多余的上清液。 将细胞沉淀重悬于 表2制备的抗体预混液中。用 CD14 抗体和 OSCAR 同种型对照对 OSCAR 同型对照管进行染色，以代替 OSCAR 抗体。 将细胞在4°C避光孵育30分钟。 30分钟后，通过加入五体积的细胞分选缓冲液洗涤细胞，并在4°C下以400× g 离心5分钟。 将细胞重悬于300-1，000μL冷细胞分选缓冲液中，并使用装有100μM喷嘴的流式细胞术分选机采集细胞。注意：OC是非常粘性的细胞，因此在分选之前通过无菌的70μm膜过滤它们很重要。 将OC和前OC作为CD14−OSCAR+进行门控。根据OSCAR同种型对照管设置OSCAR+门。 将分选的细胞收集在聚丙烯试管中，该试管含有完整的α-MEM，在8°C下补充有20S。 分选后，通过在室温下以300×g离心5分钟来沉淀细胞，对细胞进行计数，并重悬用于下游应用。注意：通常，要获得~1 x 105 个分类的预OC / OC，请从第0天接种的~10 x 106 个细胞开始。低回收率受与Accutase分离期间的细胞损失以及染色和分选处理的影响。建议使用无菌缓冲液和试剂进行整个过程，并在无菌条件下工作。 9. 线粒体活性的ATP测定 在M-CSF和RANKL存在下，以与前面描述相同的方式在96孔板中孵育富集的CD14 + 单核细胞（步骤4.1-4.8）。将四个额外条件一式三份板以用作对照。 根据制造商手册使用发光ATP检测试剂盒进行ATP测定。简而言之，为了制备ATP溶液，将10mL的底物缓冲溶液添加到冻干的底物中，并将其在室温下孵育30分钟。注意：可以使用不同的方法来测量细胞内ATP的产生。在这里，我们使用了通过发光检测ATP的产生。 在孵育期间，准备对照品并将其直接添加到对照孔中，如下所示：10mM和100mM的2-脱氧-D-葡萄糖（2DG），1μM的寡霉素和100mM 2DG与1μM寡霉素的组合。在37°C下用5%CO2孵育30分钟。注意：2DG阻断糖酵解，而寡霉素是氧化磷酸化的抑制剂。结合这两种抑制剂导致通过糖酵解和氧化磷酸化 完全 失去ATP的产生，因此这意味着它们可作为ATP测定的内部对照。对于 10 mM 和 100 mM 2DG 对照，每 100 μL 培养孔分别加入 0.5 μL 和 5 μL 2M 2DG 储备溶液。对于 1 μM 寡霉素，将 5 mM 储备溶液在培养基中以 1：100 稀释，并向专用对照孔中加入 2 μL/孔。对于最后一个对照，每孔加入 5 μL 2DG 和 2 μL 稀释的寡霉素溶液。 向每个孔中加入 50 μL ATP 溶液以停止反应，并在室温下以 700 rpm 在振荡器上避光孵育 5-10 分钟。 将 100 μL 上清液转移到特定于 ATP 测定的 96 孔白底板上，并使用发光读数器读取板。