Este artigo detalha os métodos diagnósticos de cardiopatia congênita murina (DCC) usando ecocardiografia fetal, necropsia e captura de imagem de fluorescência episcópica (EFIC) usando microscopia confocal episcópica (ECM) seguida de reconstrução tridimensional (3D).
As cardiopatias congênitas (DCC) são as principais causas de morte infantil nos Estados Unidos. Na década de 1980 e anteriores, a maioria dos pacientes com DCC moderada ou grave morreu antes da idade adulta, com a mortalidade máxima durante a primeira semana de vida. Avanços notáveis em técnicas cirúrgicas, abordagens diagnósticas e manejo médico levaram a melhorias marcantes nos resultados. Para atender às necessidades críticas de pesquisa da compreensão de defeitos cardíacos congênitos, os modelos murinos forneceram uma plataforma de pesquisa ideal, pois têm anatomia cardíaca muito semelhante à dos seres humanos e taxas de gestação curtas. A combinação de engenharia genética com ferramentas de fenotipagem de alto rendimento permitiu a replicação e o diagnóstico de defeitos cardíacos estruturais para elucidar ainda mais as vias moleculares por trás das DCC. O uso da ecocardiografia fetal não invasiva para rastrear os fenótipos cardíacos em modelos de camundongos, juntamente com a alta fidelidade da captura de imagem de fluorescência episcópica (EFIC) usando a histopatologia da microscopia confocal episcopada (ECM) com reconstruções tridimensionais (3D), permite uma visão detalhada da anatomia de vários defeitos cardíacos congênitos. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho completo desses métodos para obter um diagnóstico preciso de defeitos cardíacos congênitos murinos. A aplicação deste protocolo de fenotipagem a organismos modelo permitirá um diagnóstico preciso de DCC, produzindo insights sobre os mecanismos da DCC. Identificar os mecanismos subjacentes da DCC oferece oportunidades para potenciais terapias e intervenções.
As cardiopatias congênitas (DCC) são o defeito congênito neonatal mais comum 1,2, acometendo cerca de 0,8%-1,7% dos neonatos e resultando em mortalidade e morbidade neonatais significativas3. A etiologia genética é fortemente indicada com DCC 4,5. Modelos de camundongos geneticamente modificados têm sido amplamente utilizados para entender a complexidade das DCCs e os mecanismos que as causam devido aos camundongos terem corações de quatro câmaras e sequências de DNA de desenvolvimento cardíaco comparáveis em fetos de camundongos e humanos6. Identificar o fenótipo dos mutantes de camundongos é o primeiro passo fundamental para caracterizar a função do gene alvo. Modelos de camundongos que expressam efeitos de dosagem gênica, nos quais uma única mutação genética pode resultar em um espectro de defeitos cardíacos que imitam as DCCs humanas, são importantes para a compreensão da complexidade das DCCs e dos mecanismos que as causam.
Este artigo descreve um pipeline para caracterizar fenótipos cardíacos em modelos de camundongos. Os métodos aplicados utilizam o ecocardiograma fetal 7, seguido de necropsia e histopatologia da MEC7,8, que pode exibir a anatomia detalhada do desenvolvimento de fenótipos cardíacos murinos. O ecocardiograma fetal é uma modalidade não invasiva que permite a visualização direta de múltiplos embriões com resolução de imagem razoável. Além disso, um ecocardiograma fetal fornece uma determinação rápida do número total de embriões em uma ninhada, seus estágios de desenvolvimento e a orientação relativa e localização no corno uterino. Usando um Doppler/fluxo de cor espectral, embriões anormais podem ser identificados com base na estrutura, no distúrbio hemodinâmico, na restrição de crescimento ou no desenvolvimento de hidropisia hidropissexual. Como o estudo do ecocardiograma fetal é uma técnica não invasiva, ele pode ser usado para fazer a varredura em vários dias e observar as alterações na hemodinâmica ou morfologia cardíaca. A obtenção de imagens de alta qualidade de ecocardiogramas fetais requer prática e habilidade, pois defeitos cardíacos específicos podem ser perdidos devido à falta de experiência e conhecimento. Devido a isso, uma análise mais definitiva da morfologia cardíaca pode ser obtida através de uma combinação de necropsia e histopatologia da MEC. A necropsia fornece visualização direta da estrutura do arco, das relações relativas da aorta e da artéria pulmonar, do tamanho dos ventrículos e átrios, da posição do coração em relação ao tórax e das estruturas broncopulmonares. No entanto, características internas, como as válvulas cardíacas e a espessura da parede, podem ser difíceis de avaliar apenas através da necropsia. Assim, a histopatologia da ECM é recomendada para um diagnóstico conclusivo. A histopatologia da ECM é uma técnica de visualização de alta resolução que permite a reconstrução 2D e 3D da pilha de imagens9. Essas imagens são obtidas por meio de imagens fluorescentes episcoscópicas seriais de uma amostra embutida em parafina, pois é finamente seccionada em um intervalo consistente por um micrótomo automático. Ao contrário da histologia clássica, as imagens são capturadas como uma seção antes de serem cortadas do bloco, de modo que todas as imagens sejam capturadas dentro do mesmo quadro de referência. Devido a isso, a pilha de imagens 2D produzida pela histopatologia da ECM pode ser facilmente e de forma confiável reconstruída em três dimensões. Isso é feito usando um visualizador DICOM, que permite a visualização 3D das imagens nos três planos anatômicos: coronal, sagital e transversal. A partir dessas reconstruções 3D de alta resolução, um diagnóstico cardíaco definitivo pode ser feito. A aplicação dessas três diferentes modalidades de visualização, individualmente ou em combinação, pode fornecer caracterizações precisas de defeitos cardíacos estruturais em embriões de camundongos.
Camundongos geneticamente modificados têm sido usados para entender os patomecanismos de defeitos cardíacos congênitos. Os protocolos que fornecemos neste estudo tentam agilizar e padronizar o processo de avaliação de defeitos cardíacos fetais murinos. No entanto, existem etapas críticas a serem observadas durante o protocolo. Os embriões de camundongos crescem significativamente durante cada dia de gestação, e o tempo correto para colher um camundongo pode ser determinado pela realização de um ecocardiograma…
The authors have nothing to disclose.
Nenhum.
1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
Embedding molds | Sakura | 4133 | |
Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |