微生物・化学刺激による好中球細胞外トラップの形態・組成解析

好中球は血流中に最も豊富な白血球であり、DNAといくつかの核、細胞質、および粒状の抗菌タンパク質で構成される大きなクロマチン構造の放出を含む、いくつかのメカニズムによる病原体の除去中に重要な役割を果たします^1,2。好中球のこの抗菌的役割を記述する直接の前例は、1996^年に武井らによってなされた3。これらの著者らは、好中球のアポトーシスおよびネクロトーシスとは異なる新しい形態の死を報告し、核破裂を示す形態学的変化を示し、その後、核質から細胞質にこぼれ、ホルボールミリスチン酸酢酸塩(PMA)との3時間のインキュベーションから膜透過性の増加を示しました^2,3。しかし、「好中球細胞外トラップ(NET)」という用語が使用されたのは2004年のことでした⁴。

NET形成は、細菌、真菌⁵、ウイルス⁶、寄生虫感染などのさまざまな条件で観察されており、微生物の拡散を中和、死滅、および防止します⁷。他の研究は、サイトカイン、尿酸一ナトリウムまたはコレステロール結晶、自己抗体、免疫複合体、および活性化血小板などの滅菌刺激によって非病原性状態でも起こり得ることを示している⁷。リポ多糖(LPS)、インターロイキン-8(IL-8)、およびPMAは、NET誘導物質として記載された最初のin vitro刺激の1つであり、病原性プロセスへのin vivoNETの関与は、急性炎症の2つのモデル、実験的赤痢と自然発生性ヒト虫垂炎で実証されました⁴。DNAは不可欠なNETコンポーネントです。NETとその殺菌特性を分解する短時間のデオキシリボヌクレアーゼ(DNase)処理によって実証されるように、その適切な構造と組成は、捕獲された微生物に向かって高濃度の抗菌分子を送達することにより、微生物の隔離と死滅に必要です⁴。DNAに加えて、NETは、ヒストン、好中球エラスターゼ(NE)、カテプシンG(CG)、プロテイナーゼ3、ラクトフェリン、ゼラチナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、およびカチオン性炎症誘発ペプチドカテリシジンLL-37などの抗菌ペプチド(AMP)などの付着タンパク質を含む^8,9。そのような凝集体は、最大50nmの直径を有するより大きな糸を形成し得る。これらの要因は、微生物の病原性因子または病原体細胞膜の完全性を破壊する可能性があります。さらに、AMPは、細菌ヌクレアーゼによる分解に対してNET由来のDNAを安定化させることができる¹⁰。

NET形成を制御する具体的なメカニズムはまだ完全には解明されていません。NET放出につながる最も特徴のある経路は、NADPHオキシダーゼの活性化と活性酸素種(ROS)産生につながるERKシグナル伝達、およびMPO経路の活性化を引き起こす細胞内カルシウムの増加によるものです。これにより、過酸化水素が次亜塩素酸に変換され、酸化によってNEが活性化されます^11,12。NEは、細胞骨格のアクチンフィラメントを分解して食作用をブロックし、それらを核に移動して、顆粒および細胞質タンパク質と会合し、細胞外に放出されるクロマチン線維の脱感作を促進するPAD4によるタンパク質分解切断および脱アミノ化による処理を行います⁷。これらのプロテアーゼとしては、アズロフィル顆粒のアズロソーム複合体やカテプシン^G13などの他のプロテアーゼから放出されるものが挙げられる。

好中球の形態学的変化に応じて、NETは2つのタイプに分類されます:細胞死につながる自殺または溶解性のNET形成⁴、および貪食能力を備えた核細胞またはミトコンドリアDNAの小胞放出によって媒介される生存細胞によって生成されるバイタルまたは非溶解性のNET形成^14,15。一般に、ミトコンドリアDNAからなるNETは細長い繊維¹⁴形態を示し、一方核DNAから構成されたものは雲^{のような外観3}を有する。しかしながら、好中球がそのDNA起源をどのように選択するかは知られていない。NETの標準的な経路が数時間かかると説明していた以前の研究とは対照的に、バイタル経路はわずか5〜60分で急速に活性化されます¹⁵。

これらの進歩にもかかわらず、NET組成は刺激によって異なります。例えば、緑膿菌の異なるムコイド株および非ムコイド株は、33個の共通タンパク質および最大50個の可変タンパク質を含むNETの形成を誘導する⁷。したがって、研究グループで客観的な結論を生み出すことを可能にする技術を均質化する必要があります。本稿では、黄色ブドウ球菌(グラム陽性菌)、緑膿菌(グラム陰性菌)、カンジダ・アルビカンス(真菌)、および健常人のヒト好中球の化学刺激(PMA、HOCl)など、さまざまな微生物で誘導されたNETの組成、構造、形態を比較および評価できるさまざまな手法によるプロトコルについて説明します。代表的な結果は、DNA-DAPI染色、LL37の免疫染色、および酵素活性(NE、CG、およびMPO)の定量を特徴とする、同等のin vitro条件下での誘導刺激に依存するNETの不均一性を示しています。