微生物和化学刺激诱导的中性粒细胞胞外陷阱的形态学和组成分析

中性粒细胞是血液中最丰富的白细胞，在通过多种机制清除致病剂的过程中起着至关重要的作用，包括释放由DNA和几种核，细胞质和颗粒抗菌蛋白组成的大染色质结构^1，2。描述中性粒细胞这种抗菌作用的直接前因是由Takei等人于1996^年提出的。这些作者报告了一种不同于中性粒细胞凋亡和坏死性凋亡的新死亡形式，表现出表现出核破裂的形态变化，然后从核质溢出到细胞质中，并且膜通透性从与佛波肉豆蔻酸酯（PMA^）孵育3小时后增加2^，3。然而，直到2004年才使用术语“中性粒细胞细胞外陷阱（NET）”⁴。

在细菌、真菌⁵、病毒⁶ 和寄生虫感染等各种条件下观察到 NET 形成，用于中和、杀死和防止微生物传播⁷。其他研究表明，它也可以通过无菌刺激在非致病条件下发生，例如细胞因子、尿酸单钠或胆固醇晶体、自身抗体、免疫复合物和活化的血小板⁷.脂多糖（LPS），白细胞介素-8（IL-8）和PMA是最早被描述为NET诱导剂的 体外 刺激，并且在两种急性炎症模型中 证明了体内 NET参与致病过程：实验性痢疾和自发性人阑尾炎⁴。DNA是必不可少的NET成分。其适当的结构和组成对于通过向捕获的微生物提供高局部浓度的抗菌分子来隔离和杀死微生物是必要的，正如分解NET及其杀^{微生物特性的}简短脱氧核糖核酸酶（DNase）处理所证明的那样4。除 DNA 外，NET 还包括附着蛋白，例如组蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶 （NE）、组织蛋白酶 G （CG）、蛋白酶 3、乳铁蛋白、明胶酶、髓过氧化物酶 （MPO） 和抗菌肽 （AMP），例如阳离子促炎肽 cathelicidin LL-37 等^8，9。这种聚集体可以形成直径达50nm的较大螺纹。这些因素可以破坏微生物毒力因子或病原体细胞膜的完整性;此外，AMPs可以稳定NET衍生的DNA，防止细菌核酸酶降解¹⁰。

调控NET形成的具体机制尚未完全明确。导致NET释放的最佳特征途径是通过ERK信号传导，这导致NADPH氧化酶活化和活性氧（ROS）产生，以及触发MPO途径激活的细胞内钙增加。这反过来将过氧化氢转化为次氯酸，通过氧化^{激活NE 11，12}。NE负责降解细胞骨架的肌动蛋白丝以阻断吞噬作用，并将它们转移到细胞核中，通过蛋白水解切割和PAD4脱氨进行处理，PAD4驱动染色质纤维脱敏，染色质纤维与颗粒和细胞质蛋白结合，然后细胞外释放^7。这些蛋白酶包括从藜红细胞颗粒的azurosome复合物释放的蛋白酶和其他蛋白酶（例如组织蛋白酶G¹³）。

根据中性粒细胞的形态变化，NET分为两种类型：导致^{细胞死亡的}自杀性或溶解性NET形成4，以及由核或线粒体DNA囊泡释放介导的活细胞产生的重要或非溶解NET形成，具有吞噬能力的无核细胞质体的残余^14，15。通常，由线粒体DNA组成的NETs呈现细长的纤维¹⁴ 形态，而由核DNA结构的NET具有云状外观³。然而，目前尚不清楚中性粒细胞如何选择其DNA起源。与先前将NET的规范途径描述为需要几个小时的研究相反，重要途径在5-60分钟内迅速激活¹⁵。

尽管取得了这些进展，但NET的组成因刺激措施而异;例如，铜绿假单胞菌的不同粘液和非粘液菌株诱导含有33种常见蛋白质和多达50种^{可变蛋白质的}NETs的形成7。因此，有必要使允许在研究小组中产生客观结论的技术同质化。本文描述了一种具有各种技术的协议，可以比较和评估由不同微生物诱导的NET的组成，结构和形态：金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌），铜绿假单胞菌（革兰氏阴性细菌）和白色念珠菌（真菌），以及来自健康个体的人中性粒细胞中的化学刺激（PMA，HOCl）。代表性结果表明，NETs的异质性取决于其在可比体外条件下的诱导刺激，其特征在于DNA-DAPI染色，LL37免疫染色和酶活性定量（NE，CG和MPO）。