Coleta de exsudatos radiculares de alfafa para estudo do impacto do ftalato de di(2-etilhexil) na produção de metabólitos
Summary
A secreção de exsudatos radiculares é geralmente uma estratégia de desintoxicação externa para plantas sob condições de estresse. Este protocolo descreve como avaliar o impacto de xenobióticos na alfafa através de análise metabolômica não direcionada.
Abstract
Os exsudatos radiculares são os principais meios de comunicação de informação e transferência de energia entre as raízes das plantas e o ambiente circundante. A alteração na secreção de exsudatos radiculares é geralmente uma estratégia de desintoxicação externa para plantas sob condições de estresse. Este protocolo visa introduzir diretrizes gerais para a coleta de exsudatos radiculares de alfafa para estudar o impacto do ftalato de di(2-etilhexil) (DEHP) na produção de metabólitos. Primeiro, mudas de alfafa são cultivadas sob estresse de DEHP em um experimento de cultivo hidropônico. Em segundo lugar, as plantas são transferidas para tubos de centrífuga contendo 50 mL de água ultrapura esterilizada por 6 h para coletar exsudatos radiculares. As soluções são então liofilizadas em um liofilizador a vácuo. As amostras congeladas são extraídas e derivatizadas com o reagente bis(trimetilsilil)) trifluoroacetamida (BSTFA). Posteriormente, os extratos derivatizados são medidos usando um sistema de cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massas por tempo de voo (GC-TOF-MS). Os dados de metabólitos adquiridos são então analisados com base em métodos de bioinformática. Metabólitos diferenciais e vias metabólicas significativamente alteradas devem ser profundamente explorados para revelar o impacto do DEHP na alfafa em vista dos exsudatos radiculares.
Introduction
O ftalato de di(2-etilhexil) (DEHP) é um composto químico sintético que é amplamente utilizado em vários plásticos e polímeros como plastificante para melhorar sua plasticidade e resistência. Nos últimos anos, um número crescente de estudos tem sugerido que o DEHP é um disruptor endócrino e tem efeito adverso sobre os sistemas respiratório, nervoso e reprodutivo de humanos e outros animais 1,2,3. Considerando seu risco à saúde, a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos, a União Europeia e o Centro de Monitoramento Ambiental da China classificaram o DEHP na lista de poluentes prioritários. O solo tem sido considerado um importante sumidouro de DEHP no meio ambiente, devido à aplicação de cobertura morta plástica e fertilizantes orgânicos, irrigação com água residuária e aplicação de lodo4. Como esperado, o DEHP tem sido detectado de forma ubíqua em solos de terras agrícolas, cujo conteúdo chega a atingir até miligramas por quilograma de solo seco em algumas regiões da China 5,6. O DEHP pode entrar nas plantas principalmente pelas raízes e sofrer biomagnificação em diferentes níveis tróficos nos ecossistemas edáficos7. Portanto, uma preocupação significativa tem sido levantada sobre o estresse induzido pelo DEHP em plantas nas últimas décadas.
As plantas são geralmente vulneráveis à exposição ao DEHP. Observou-se que o estresse DEHP exerce um efeito adverso sobre a germinação e o metabolismo normal das sementes, inibindo o crescimento e desenvolvimento das plantas 8,9. Por exemplo, o DEHP pode induzir danos oxidativos às células do mesofilo, diminuir o conteúdo de clorofila e osmólitos e elevar a atividade enzimática antioxidante, resultando eventualmente em declínio na produtividade e qualidade de plantas comestíveis10,11. No entanto, a maioria dos estudos prévios sobre a resposta das plantas ao estresse por DEHP tem se concentrado no estresse oxidativo e nas características fisiológicas e bioquímicas. Os mecanismos correspondentes associados ao metabolismo vegetal são menos estudados. Exsudato radicular é um termo genérico que descreve compostos que as raízes das plantas secretam e liberam no ambiente. Eles têm sido considerados como o meio de interação entre as plantas e o solo rizosférico, desempenhando um papel importante no suporte ao crescimento e desenvolvimento das plantas12. Sabe-se que os exsudatos radiculares são responsáveis por aproximadamente 30%-40% de todo o carbonofotossintético13. Em ambientes poluídos, exsudatos radiculares estão envolvidos na melhoria da tolerância das plantas ao estresse de poluentes por meio de metabolismo ou exclusão externa14. Como consequência, uma compreensão profunda da resposta dos exsudatos radiculares das plantas ao estresse poluidor pode ajudar a revelar os mecanismos subjacentes associados à bioquímica celular e aos fenômenos biológicos15.
A tecnologia metabolômica fornece uma estratégia eficiente para medir um grande número de metabólitos de pequenas moléculas simultaneamente dentro das células 16,17, tecidos18 e até mesmo exsudatos de organismos 19, incluindo açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos e lipídios. Em comparação com métodos de análise química tradicionais ou clássicos, a abordagem metabolômica aumenta consideravelmente o número de metabólitos que podem ser detectados20, o que pode ajudar a identificar metabólitos de uma maneira de maior rendimento e identificar as principais vias metabólicas. A metabolômica tem sido amplamente utilizada no campo de pesquisa da resposta biológica em ambientes de estresse, como metais pesados21, poluentes emergentes22 e nanopartículas19. A maioria desses estudos em plantas tem se concentrado nas alterações metabólicas nos tecidos interiores das plantas, enquanto poucos têm sido relatados sobre a resposta dos exsudatos radiculares ao estresse ambiental. Portanto, o objetivo deste estudo é apresentar diretrizes gerais para a coleta de exsudatos radiculares de alfafa para estudar o impacto do DEHP na produção de metabólitos. Os resultados fornecerão uma orientação metodológica para o estudo de acompanhamento da metabolômica vegetal pelo DEHP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo fornece orientação geral sobre como coletar e medir os exsudatos radiculares da alfafa sob estresse DEHP, bem como analisar os dados do metaboloma. É preciso prestar muita atenção a algumas etapas críticas desse protocolo. Em experimentos de cultivo hidropônico, plântulas de alfafa foram cultivadas hidroponicamente em frascos de vidro preenchidos com soluções nutritivas com diferentes concentrações de DEHP. Os frascos de vidro devem ser protegidos da luz, cobrindo-os com papel alumínio durante…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado conjuntamente pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (41877139), os Grandes Projetos da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (41991335), o Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Chave da China (2016YFD0800204), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (No. BK20161616), o Plano “135” e o Programa de Fronteiras da Academia Chinesa de Ciências (ISSASIP1615).
Materials
| Adonitol | SIGMA | ≥99% | |
| Alfalfa seeds | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
| Analytical balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Chromatographic column | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm) | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| Gas chromatography(GC) | Agilent | 7890A | |
| Grinding instrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| Mass spectrometer(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
| Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Pyridine | Adamas | HPLC | |
| R software | statistical analysis software (pathway enrichment, topology) | ||
| SIMCA16.0.2 | statistical analysis software (OPLS-DA etc) | ||
| Ultra low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
| Ultrasound | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Vacuum dryer | Taicang Huamei biochemical instrument factory | LNG-T98 |
Referenzen
- Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053 (2021).
- Seyoum, A., Pradhan, A. Effect of phthalates on development, reproduction, fat metabolism and lifespan in Daphnia magna. The Science of the Total Environment. 654, 969-977 (2019).
- van T Erve, T. J., et al. Phthalates and phthalate alternatives have diverse associations with oxidative stress and inflammation in pregnant women. Environmental Science & Technology. 53 (6), 3258-3267 (2019).
- He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
- Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: an investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
- Li, K. K., Ma, D., Wu, J., Chai, C., Shi, Y. X. Distribution of phthalate esters in agricultural soil with plastic film mulching in Shandong Peninsula, East China. Chemosphere. 164, 314-321 (2016).
- Sun, J., Wu, X., Gan, J. Uptake and metabolism of phthalate esters by edible plants. Environmental Science & Technology. 49 (14), 8471-8478 (2015).
- Kim, D., Cui, R., Moon, J., Kwak, J. I., An, Y. J. Soil ecotoxicity study of DEHP with respect to multiple soil species. Chemosphere. 216, 387-395 (2019).
- Gao, M. L., Qi, Y., Song, W. H., Xu, H. R. Effects of di-n-butyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate on the growth, photosynthesis, and chlorophyll fluorescence of wheat seedlings. Chemosphere. 151, 76-83 (2016).
- Zhang, Y., et al. Effects of diethylphthalate and di-(2-ethyl)hexylphthalate on the physiology and ultrastructure of cucumber seedlings. Environmental Science and Pollution Research. 21 (2), 1020-1028 (2014).
- Gao, M. L., Liu, Y., Dong, Y. M., Song, Z. G. Physiological responses of wheat planted in fluvo-aquic soils to di (2-ethylhexyl) and di-n-butyl phthalates. Environmental Pollution. 244, 774-782 (2019).
- Lundberg, D. S., Teixeira, P. J. P. L. Root-exuded coumarin shapes the root microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5629-5631 (2018).
- Canarini, A., Kaiser, C., Merchant, A., Richter, A., Wanek, W. Root exudation of primary metabolites: mechanisms and their roles in plant responses to environmental stimuli. Frontiers in Plant Science. 10, 157 (2019).
- Chai, Y. N., Schachtman, D. P. Root exudates impact plant performance under abiotic stress. Trends in Plant Science. 27 (1), 80-91 (2022).
- Olanrewaju, O. S., Ayangbenro, A. S., Glick, B. R., Babalola, O. O. Plant health: feedback effect of root exudates-rhizobiome interactions. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (3), 1155-1166 (2019).
- Chamberlain, C. A., Hatch, M., Garrett, T. J. Metabolomic and lipidomic characterization of Oxalobacter formigenes strains HC1 and OxWR by UHPLC-HRMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4807-4818 (2019).
- vander Hooft, J. J. J., Goldstone, R. J., Harris, S., Burgess, K. E. V., Smith, D. G. E. Substantial extracellular metabolic differences found between phylogenetically closely related probiotic and pathogenic strains of Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 252 (2019).
- Liu, N., Zhu, L. Metabolomic and transcriptomic investigation of metabolic perturbations in Oryza sativa L. triggered by three pesticides. Environmental Science & Technology. 54 (10), 6115-6124 (2020).
- Zhao, L., et al. H-1 NMR and GC-MS based metabolomics reveal defense and detoxification mechanism of cucumber plant under nano-Cu stress. Environmental Science & Technology. 50 (4), 2000-2010 (2016).
- Llanes, A., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A., Luna, V. Metabolomic profiling of the halophyte Prosopis strombulifera shows sodium salt- specific response. Plant Physiology and Biochemistry. 108, 145-157 (2016).
- Zhang, Y., et al. Zinc stress affects ionome and metabolome in tea plants. Plant Physiology and Biochemistry. 111, 318-328 (2017).
- Wright, R. J., Bosch, R., Gibson, M. I., Christie-Oleza, J. A. Plasticizer degradation by marine bacterial isolates: a proteogenomic and metabolomic characterization. Environmental Science & Technology. 54 (4), 2244-2256 (2020).
- He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Wang, Y. T., et al. Nontargeted metabolomic analysis to unravel the impact of di (2-ethylhexyl) phthalate stress on root exudates of alfalfa (Medicago sativa). The Science of the Total Environment. 646, 212-219 (2019).
- Yu, Q., et al. Photolysis of bis(2-ethylhexyl) phthalate in aqueous solutions at the presence of natural water photoreactive constituents under simulated sunlight irradiation. Environmental Science and Pollution Research International. 26 (26), 26797-26806 (2019).
- Zhang, S. H., Guo, A. J., Fan, T. T., Zhang, R., Niu, Y. J. Phthalates in residential and agricultural soils from an electronic waste-polluted region in South China: distribution, compositional profile and sources. Environmental Science and Pollution Research. 26 (12), 12227-12236 (2019).
- Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: An investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
- Fan, T. W., Lane, A. N., Pedler, J., Crowley, D., Higashi, R. M. Comprehensive analysis of organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 251 (1), 57-68 (1997).
- Bobille, H., et al. Evolution of the amino acid fingerprint in the unsterilized rhizosphere of a legume in relation to plant maturity. Soil Biology and Biochemistry. 101, 226-236 (2016).
- Zhang, Z., et al. Effects of two root-secreted phenolic compounds from a subalpine coniferous species on soil enzyme activity and microbial biomass. Chemistry and Ecology. 31 (7), 636-649 (2015).
- Yuan, J., et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports. 5, 13438 (2015).
- van Dam, N. M., Bouwmeester, H. J. Metabolomics in the rhizosphere: tapping into belowground chemical communication. Trends in Plant Science. 21 (3), 256-265 (2016).
- Shen, X., Yang, F., Xiao, C., Zhou, Y. Increased contribution of root exudates to soil carbon input during grassland degradation. Soil Biology & Biochemistry. 146, 107817 (2020).
- Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates-mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
- Zhang, L. Effects of root exudates of wheat stressed by Cd on the germination of crop seeds. International Symposium on Water Resources and the Urban Environment. , 319-321 (2003).
- Shinano, T., et al. Metabolomic analysis of night-released soybean root exudates under high- and low-K conditions. Plant and Soil. 456, 259-276 (2020).
- Adeleke, R., Nwangburuka, C., Oboirien, B. Origins, roles and fate of organic acids in soils: A review. South African Journal of Botany. 108, 393-406 (2017).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings. Environmental Science & Technology. 47 (24), 14110-14118 (2013).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Vodovnik, M., Marinsek-Logar, R., Kahru, A. Exposure to CuO nanoparticles changes the fatty acid composition of protozoa Tetrahymena thermophila. Environmental Science & Technology. 45 (15), 6617-6624 (2011).
- Liao, Q. H., et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils. Science of the Total Environment. 764, 144436 (2021).
- Ding, Y., et al. Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses. Plant, Cell & Environment. 44 (12), 3526-3544 (2021).
- Rugova, A., Puschenreiter, M., Koellensperger, G., Hann, S. Elucidating rhizosphere processes by mass spectrometry-A review. Analytica Chimica Acta. 956, 1-13 (2017).
