Un protocole de défrichement efficace pour l’étude du développement des semences de tomates (Solanum lycopersicum L.)

La tomate (S. lycopersicum L.) est l’une des cultures légumières les plus importantes au monde, avec une production de 186,8 millions de tonnes de fruits charnus sur 5,1 millions d’hectares en 2020¹. Il appartient à la grande famille des solanacées avec environ 2 716 espèces², y compris de nombreuses cultures commercialement importantes telles que l’aubergine, les poivrons, la pomme de terre et le tabac. La tomate cultivée est une espèce diploïde (2n = 2x = 24) avec une taille de génome d’environ 900 Mb³. Pendant longtemps, de grands efforts ont été faits pour la domestication et la reproduction de la tomate en sélectionnant des caractères souhaitables chez Solanum spp. Il y a plus de 5 000 accessions de tomates répertoriées dans le Centre de ressources génétiques sur la tomate et plus de 80 000 germoplasmes de tomates sont stockés dans le monde⁴. Le plant de tomate est vivace en serre et se propage par graines. Une graine de tomate mature se compose de trois compartiments principaux : un embryon adulte, un endosperme résiduel de type cellulaire et un tégument dur ^5,6 (figure 1A). Après une double fécondation, le développement de l’endosperme de type cellulaire précède le développement des zygotes. À ~5-6 jours après la floraison (DAF), le proembryon bicellulaire est observé pour la première fois lorsque l’endosperme est constitué de six à huit noyaux⁷. Chez Solanum pimpinellifolium, l’embryon approche de sa taille finale après 20 DAF, et les graines sont viables pour la germination après 32 DAF⁸. Au fur et à mesure que l’embryon se développe, l’endosperme est progressivement absorbé et seule une petite quantité d’endosperme reste dans la graine. L’endosperme résiduel est constitué d’endosperme micropylaire entourant l’extrémité radiculaire et d’endosperme latéral dans le reste de la graine ^9,10. Le tégument externe est développé à partir de l’épiderme externe épaissi et lignifié du tégument, et avec les couches mortes de restes de tégument, ils forment une coquille dure pour protéger l’embryon et l’endosperme⁵.

Figure 1 : Représentation schématique d’une graine mature chez Solanum lycopersicum et Arabidopsis thaliana. (A) Anatomie longitudinale d’une graine de tomate mature. (B) Anatomie longitudinale d’une graine d’Arabidopsis mature. Une graine de tomate mûre est environ 70 fois plus grande qu’une graine d’Arabidopsis. Barres d’échelle = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La production de semences de tomates de haute qualité dépend de la coordination entre l’embryon, l’endosperme et les composants maternels^{des semences 11}. La dissection de gènes et de réseaux clés dans le développement des semences nécessite un enregistrement phénotypique approfondi et complet des graines mutantes. Les techniques conventionnelles d’encastrement-section, telles que la section semi-mince et la section de paraffine, sont largement appliquées aux graines de tomates pour observer les structures locales et plus fines de l’embryon^12,13,14,15. Cependant, l’analyse du développement des graines à partir de sections minces est généralement laborieuse et manque de résolution spatiale de l’axe z. En comparaison, la clairsemage tissulaire est une méthode rapide et efficace pour déterminer le stade de développement des anomalies embryonnaires les plus susceptibles de se produire¹⁶. La méthode de nettoyage réduit l’opacité des tissus internes en homogénéisant l’indice de réfraction avec un ou plusieurs agents biochimiques¹⁶. Le nettoyage des tissus entiers permet d’observer la structure d’un tissu végétal sans détruire son intégrité, et la combinaison de la technologie de nettoyage et de l’imagerie tridimensionnelle est devenue une solution idéale pour obtenir des informations sur la morphologie et l’état de développement d’un organe végétal^17,18. Au fil des ans, des techniques de débroussaillage ont été utilisées chez diverses espèces végétales, notamment Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare et Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Parmi celles-ci, la technologie de défrichage des ovules à montage entier a été une approche efficace pour étudier le développement des graines d’Arabidopsis, en raison de sa petite taille, de ses 4-5 couches de cellules de tégument et de l’endosperme de type nucléaire^24,25. Avec la mise à jour continue de différents mélanges de nettoyage, tels que l’émergence de la solution²⁶ de Hoyer, les structures internes de l’ovule d’orge ont été imagées avec un haut degré de clarté, bien que son endosperme constitue la majeure partie des graines. L’embryogenèse de la betterave sucrière peut être observée par débroussaillage combiné à un traitement sous vide et ramollissement à l’acide chlorhydrique¹⁹. Néanmoins, contrairement aux espèces mentionnées ci-dessus, les observations embryologiques par protocoles de nettoyage dans les graines de tomates n’ont pas été rapportées. Cela empêche une étude détaillée du développement embryonnaire et des semences de tomates.

L’hydrate de chloral est couramment utilisé comme solution de compensation qui permet aux tissus immergés et aux cellules d’être affichés sur différents plans optiques et préserve considérablement les cellules ou les composants tissulaires^27,28,29. Le protocole de nettoyage à base d’hydrate de chloral a été utilisé avec succès pour le nettoyage complet des graines afin d’observer l’embryon et l’endosperme d’Arabidopsis^21,28. Cependant, cette solution de nettoyage n’est pas efficace pour éliminer les graines de tomates, qui sont plus imperméables que les graines d’Arabidopsis. Les barrières physiques comprennent: (1) le tégument de la tomate a près de 20 couches cellulaires à 3 à 15 DAF 30,31, (2) l’endosperme de la tomate est de type cellulaire, pas de type nucléaire³², et (3) les graines de tomate sont environ 70 fois plus grandes en taille^33,34 et (4) produisent de grandes quantités de mucilage de tégument^, ce qui bloque la pénétration des réactifs d’élimination et affecte la visualisation des cellules embryonnaires.

Par conséquent, ce rapport présente une méthode optimisée de nettoyage à base d’hydrate de chloral pour l’élimination complète des graines de tomates à différents stades, ce qui permet une imagerie approfondie du processus de développement de l’embryon (Figure 2).