Antikorların Candida tropicalis Biyofilmleri Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için Çözünür Tetrazolyum Bazlı İndirgeme Testi

Sistemik kandidiyazis, tüm dünyada yüksek morbidite ve mortalite oranları ile ilişkili olan hastane enfeksiyonlarının dördüncü majör nedenidir. Küresel olarak, sistemik kandidiyaz yaklaşık 700.000 kişiyi etkilemektedir¹. Candida türleri, yani C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata ve C. auris, invaziv Candida enfeksiyonlarının en yaygın nedenidir². Candida türleri, biyofilm üreten fırsatçı patojenlerdir³. Biyofilmler ağırlıklı olarak Candida virülansı ile ilişkilidir ve Candida, biyofilm oluşumunu indükleyerek oksidatif ve ozmotik stres koşullarına dayanabilir⁴. Biyofilmler ayrıca virülans faktörlerinin ve hücre duvarı bileşenlerinin ekspresyonunu modüle eder ve Candida’nın farklı konakçı nişlerine uyum sağlamasına yardımcı olan ekzopolimerik koruyucu bir matris oluşturur⁴. Biyofilmler konakçı dokularda ve tıbbi aletlerde maya yapışmasına katkıda bulunur⁵. Bu nedenle, biyofilm oluşumu mayalara bir avantaj ile ilişkilidir, çünkü biyofilmlerdeki maya hücreleri konakçı bağışıklık tepkisinden kaçabilir⁶. Biyofilm oluşumu ayrıca patojenik mayaları antifungal ilaçların etkisinden korur⁵. C. albicans biyofilmlerinin amfoterisin B’ye duyarlılığının azalması Pierce ve ^ark.7,8 tarafından gösterilmiştir. Ayrıca, biyofilmler flukonazole karşı antifungal ilaç direnci gösterir ve bu da sistemik kandidiyazisin etkin yönetimini bozar ^9,10.

Mikroplar, çeşitli biyotik ve abiyotik yüzeylere yapışma konusunda içsel bir eğilime sahiptir ve bu da biyofilm oluşumuna neden olur. Dimorfik bir mantar olan Candida albicans, maya ve hifal formlarında bulunur ve biyofilm oluşumu çeşitli in vitro ve in vivo model sistemlerde karakterize edilmiştir¹¹. Biyofilm oluşumunun aşamaları, Candida hücrelerinin substrata yapışmasını, filamentasyonu, proliferasyonu ve biyofilm olgunlaşmasını içerir¹¹. Başlangıçta, C. albicans’ın maya formu, tıbbi cihazlar ve insan dokusu da dahil olmak üzere substratlara yapışır, bunu C. albicans’ın hifal ve psödohifal formlara filamentasyonu ve çoğalması ve son olarak hücre dışı matris^11’e gömülü biyofilmlerin olgunlaşması izler. Biyofilm oluşumu C. albicans patogenez mekanizmalarına büyük ölçüde katkıda bulunur¹². Candida türleri ilaca dirençli biyofilmler oluşturur ve bu da eradikasyonlarını zorlaştırır¹³. C. albicans biyofilm üreten popülasyonun küçük bir alt kümesi, antifungal ilaçlar amfoterisin B ve klorheksidin^14’e karşı oldukça dirençli olarak tanımlanmıştır. Biyofilmlerdeki maya hücreleri, planktonik faz ve proliferasyon fazı^14’teki maya hücrelerine kıyasla çoklu ilaç tedavisine karşı yüksek direnç gösterir. Biyofilmlerde bulunan maya hücrelerinin, biyofilmlerde C. albicans’ın hayatta kalmasına katkıda bulunan antifungal ilaçlara karşı oldukça toleranslı olduğu öne sürülmüştür¹⁴. Bu mevcut hücrelerin mutantlar değil C. albicans’ın fenotipik varyantları olduğu bildirilmiştir¹⁴. Ayrıca, “kalıcı hücreler” olarak bilinen Candida biyofilmlerinin hücreleri, yüksek dozlarda amfoterisin-B tedavisine toleranslıdır ve Candida’nın hayatta kalmasına katkıda bulunur, böylece yüksek riskli bireylerde tekrarlayan sistemik Candida enfeksiyonlarının büyük bir yükünü oluşturur¹⁵.

Candida suşlarında antifungal ilaç direncindeki artış, yeni antifungal ajanlar ve immünoterapiler için araştırma yapılmasını gerektirmektedir. Yukarıda belirtilen çalışmalardan da anlaşılacağı gibi, Candida biyofilmleri antifungal ilaçlara duyarlılığın azaldığını göstermektedir. Bu nedenle, Candida biyofilm oluşumunu kontrol etmek için geliştirilmiş immünoterapilere ihtiyaç vardır. Daha önceki çalışmalar, CAGTA’nın in vitro¹⁶ C. albicans biyofilm oluşumunu inhibe ederek sistemik Candida enfeksiyonlarına karşı etkili koruma sağlayabileceğini göstermiştir. Başka bir çalışma, farelerin C. albicans rAls3-N proteini ile bağışıklanmasının, in vitro¹⁷ C. albicans biyofilm oluşumuna müdahale eden yüksek antikor titrelerini indüklediğini bildirmiştir. Anti-Als3-N antikorları ayrıca biyofilmlerden C. albicans dispersiyonu üzerinde inhibitör bir etki göstermiştir¹⁷. C. albicans’a dayanan NDV-3A aşısı şu anda klinik deneme aşamasındadır ve anti-NDV-3A serumlarının da C. auris biyofilm oluşumunu azalttığı bulunmuştur¹⁸. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, sistemik kandidiyazis^19’un murin modelinde bir koruma mekanizması olarak Sap2-antikorları tarafından biyofilm oluşumunun inhibisyonu tanımlanmıştır.

Bu yazıda, farklı Sap2 aşılı fare gruplarından elde edilen poliklonal serumda bulunan antijene özgü antikorların önceden oluşturulmuş Candida tropicalis biyofilmleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için ayrıntılı bir in vitro protokol özetlenmiştir. Bunu başarmak için, laboratuvarda, antikorların varlığında veya yokluğunda biyofilm canlılığını hızlı, hassas ve yüksek verimli bir şekilde ölçebilen bir XTT indirgeme testine dayanan bir yöntem optimize edilmiş ve geliştirilmiştir.

XTT testi, hücre canlılığının, hücresel proliferasyonun ve sitotoksisitenin bir göstergesi olarak hücresel metabolik aktiviteyi ölçmek için kullanılır²⁰. Bu kolorimetrik tahlil, sarı bir tetrazolyum tuzunun, sodyum 3′-[1-(fenilaminokarbonil)-3,4-tetrazolium]-bis (4-metoksi-6-nitro) benzen sülfonik asit hidratının (XTT) metabolik olarak aktif hücreler tarafından turuncu bir formazan boyasına indirgenmesine dayanmaktadır. Sadece canlı hücreler XTT’yi azaltabildiğinden, indirgenmiş XTT formazan miktarı, rengin yoğunluğu ve hücre canlılığı ile orantılıdır. Oluşan formazan boya suda çözünür ve bir plaka okuyucu kullanılarak doğrudan ölçülür. Suda çözünür doğası nedeniyle, XTT testi, biyofilm yapısının bozulmasından bozulmamış biyofilmlerin incelenmesine ve biyofilm ilaç duyarlılığının incelenmesine izin verir²¹. Ek olarak, bu yöntem kullanım kolaylığı, hızı, doğruluğu, yüksek verimi ve yüksek derecede tekrarlanabilirliği nedeniyle Candida mantar canlılığı değerlendirmelerinde uygulanır ^7,22.

XTT indirgeme testine ek olarak, biyofilm miktarının ölçümü için çok sayıda alternatif teknik de tanımlanmıştır. Bunlardan bazıları MTT indirgeme testi, kristal menekşe boyama, DNA nicelleştirme, kantitatif PCR, protein miktarı, kuru hücre ağırlığı ölçümü ve canlı koloni sayımının kullanımını içerir. Bu prosedürler zaman ve maliyet gereksinimleri açısından büyük farklılıklar gösterir. Taff ve ark. yedi farklı Candida biyofilm kantitasyon testinin karşılaştırmalı bir analizini gerçekleştirdiler ve XTT testinin C. albicans biyofilmleri^23’ün nicel tahmini için en tekrarlanabilir, doğru ve verimli yöntemi sağladığını buldular. Kristal menekşe gibi boyama tekniklerinin belirli sınırlamaları vardır; kristal menekşe testi, kristal menekşe boyalı biyofilm matrisinin ve hücrelerinin optik yoğunluğunu ölçerek dolaylı olarak biyofilm miktarını belirler. Kristal menekşe tahlili iyi bir biyofilm kütlesi ölçüsü sağlasa da, hem mikrobiyal hücreleri hem de hücre dışı matris^24’ü boyadığı için biyofilm canlılığının bir ölçüsünü vermez. Dhale ve ark. ayrıca, XTT indirgeme testinin, kristal menekşe testi^25’e kıyasla biyofilm üretimini tespit etmek için en hassas, tekrarlanabilir, doğru, verimli ve spesifik yöntem olduğunu bildirmiştir. Literatür raporları, XTT testinin CFU sayma yöntemindeki CFU / mL parametresi ile iyi ilişkili olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, XTT testi ile karşılaştırıldığında, CFU yöntemi emek yoğun ve yavaş^26’dır. Ayrıca, ayrılmış canlı hücrelerin fraksiyonu, başlangıçtaki biyofilm popülasyonu^27’yi temsil etmeyebilir. XTT indirgeme testi, uygulanabilirliği ölçmek için mevcut en iyi seçenek gibi görünse de, bu tekniğin birkaç sınırlaması vardır. XTT yöntemi, bir mantar suşunu içeren karşılaştırmalar için yararlı olsa da, farklı mantar suşlarını ve türlerini karşılaştırırken kullanımı sınırlı olabilir. Ayrıntılı standardizasyonun yokluğunda interstrain karşılaştırmaları zor olabilir, çünkü farklı suşlar farklı yeteneklere sahip substratları metabolize eder²¹.