Количественная оценка и анализ В-клеток миокарда на основе проточной цитометрии

В-лимфоциты являются узкоспециализированными иммунными клетками, которые играют важную роль как в адаптивных, так и во врожденных иммунных реакциях¹. Существует две основные популяции В-клеток: меньшая популяция клеток В1, которые в основном вырабатываются во время эмбриональной жизни, и преобладающая популяция клеток В2, которые производятся во взрослой жизни в костном мозге¹. После созревания в костном мозге В-клетки мигрируют в первичные и вторичные лимфоидные органы. Оттуда они непрерывно рециркулируют между лимфоидными органами, проходящими через кровеносные сосуды, и лимфатическими сосудами². В-клетки экспрессируют специфические антитела на своей поверхности, которые функционируют как рецепторы. Когда В-клетки сталкиваются с антигеном, который связывается с их рецептором, может быть запущен активирующий сигнал. Активированные В-клетки либо мигрируют в ткань, где был обнаружен антиген, либо возвращаются в костный мозг, где они могут созревать в плазматические клетки^, продуцирующие антитела ^3,4.

В последнее время было признано, что сердце содержит значительную популяцию В-клеток. Исследования на грызунах показали, что В-клетки колонизируют сердце на ранних стадиях эмбрионального развития⁵, и что В-клетки, ассоциированные с миокардом, в основном являются внутрисосудистыми, наивными B2-клетками, прилипшими к эндотелию ^6,7, с небольшим процентом клеток B1⁷. Есть еще много областей неопределенности, но имеющиеся данные указывают на то, что В-клетки играют важную роль как в наивном сердце, так и в контексте адаптации миокарда к травме.

Исследования на наивного мышиного сердца показали, что на исходном уровне В-клетки миокарда в основном располагаются во внутрисосудистом пространстве, прилипают к эндотелию (>95% мышиных сердечных В-клеток оказались расположенными во внутрисосудистом пространстве). Было обнаружено, что эти В-клетки имеют паттерны экспрессии генов, отличные от паттернов циркулирующих В-клеток, выделенных из периферической крови. Анализ наивных сердец у животных с дефицитом В-клеток и сингенного контроля показал, что животные, лишенные В-клеток, имели меньшие сердца и более высокую фракцию^{выброса 6}. Все эти данные свидетельствуют о том, что В-клетки могут модулировать рост миокарда и / или функцию миокарда, и что не только интерстициальные, но и внутрисосудистые В-клетки могут быть ответственны за такие наблюдения. Было также обнаружено, что В-клетки модулируют фенотип резидентных макрофагов миокарда⁸.

Несколько исследований показали, что В-клетки играют важную роль в контексте адаптации миокарда к травме 8,9,10,11,12,13. В-клетки временно накапливаются в поврежденном сердце, вероятно, через CXCL13-CXCR5 зависимый механизм ^11,13. Оттуда В-клетки способствуют неблагоприятному ремоделированию сердца с помощью нескольких механизмов, которые включают цитокин-опосредованный моноцит, рекрутирующий ^9,12. Кроме того, В-клетки могут вырабатывать антитела против сердечных белков, которые могут способствовать расширению сердечных повреждений и неблагоприятному ремоделированию сердца с помощью нескольких механизмов 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . В-клетки также могут оказывать защитное воздействие на поврежденное сердце через секрецию IL-10¹⁰.

По мере роста числа групп, изучающих роль В-клеток в наивном и поврежденном сердце, становится все более и более важным определить общие протоколы для правильной количественной оценки и оценки В-клеток миокарда и, таким образом, избежать несоответствий, которые уже начали появляться в литературе. До сих пор сообщалось, что В-клетки являются одними из наиболее распространенных иммунных клеток в сердце грызунов⁷ и присутствуют с заметно более низкой распространенностью, чем миелоидные клетки^26,27 или довольно редко²⁸. Аналогичным образом, несколько групп описали, что количество В-клеток миокарда увеличивается после острого ишемического повреждения миокарда^{на 7,9,13}, но одна группа сообщила об отсутствии изменений в количестве В-клеток поврежденного миокарда²⁹. Исследования сердечных иммунных клеток редко дают подробную информацию об условиях перфузии, и нет единого мнения об условиях пищеварения. Поскольку в сердце грызунов большая часть В-клеток является внутрисосудистой, а извлечение иммунных клеток из миокарда сильно зависит от используемого метода пищеварения, различия, о которых сообщается в литературе, могут быть результатом различий в перфузии органов и переваривании тканей.

Здесь представлен подробный метод количественной оценки В-клеток мышиного миокарда на основе проточной цитометрии, который максимизирует выход восстановления В-клеток за счет оптимизации условий перфузии и пищеварения и позволяет различать внутрисосудистые и внесосудистые В-клетки миокарда⁶. Этот протокол является адаптацией и оптимизацией других подобных протоколов, которые различают внутрисосудистые и интерстициальные иммунные клетки 28,30,31.

В этом протоколе мы стандартизируем перфузию миокарда для устранения В-клеток, плавающих во внутрисосудистом пространстве, без удаления биологически значимых В-клеток, прилипших к микрососудистому эндотелию. Более того, основываясь на предыдущих протоколах, которые описывали использование внутривенного введения антител для различения внутрисосудистых и интерстициальных иммунных клеток³², и используя тот факт, что В-клетки экспрессируют поверхностный маркер B220³³, мы демонстрируем, как различать внутрисосудистые и внесосудистые В-клетки миокарда посредством внутрисосудистой инъекции B220-специфического антитела непосредственно перед жертвоприношением животных и сердечной перфузией. Этот протокол актуален для исследований любого ученого, заинтересованного во включении анализа В-клеток миокарда в наивное и травмированное сердце. Широкое внедрение этого протокола уменьшит несоответствия между исследовательскими группами, позволит анализировать изменения во внутрисосудистых и внесосудистых пулах В-клеток миокарда и, таким образом, будет способствовать продвижению открытий в области иммунологии сердца.

Таким образом, протокол представляет собой оптимизированный рабочий процесс для количественной оценки и анализа В-клеток миокарда с помощью проточной цитометрии и в то же время различения клеток, расположенных во внесосудистом пространстве и внутрисосудистом пространстве.