フローサイトメトリーによる心筋B細胞の定量および分析(英語)

Bリンパ球は高度に特殊化された免疫細胞であり、適応免疫応答と自然免疫応答の両方に重要な役割を果たしています¹。B細胞には2つの主要な集団があります:主に胚期に産生されるB1細胞のより小さな集団と、骨髄¹で成人期に産生されるB2細胞の優勢集団です。骨髄で成熟した後、B細胞は一次および二次リンパ器官に移動します。そこから、血管とリンパ管を通過するリンパ器官の間を継続的に再循環します²。B細胞は、受容体として機能する特異的抗体を表面に発現します。B細胞が受容体に結合する抗原に遭遇すると、活性化シグナルがトリガーされる可能性があります。活性化されたB細胞は、抗原が発見された組織に移動するか、骨髄に戻り、そこで抗体産生形質細胞に成熟することができます^3,4。

最近、心臓にはかなりの数のB細胞が宿っていることが評価されています。げっ歯類の研究は、B細胞が胚発生の早い段階で心臓にコロニーを形成することを示し^ており5、心筋関連B細胞は主に血管内のナイーブなB2細胞であり、内皮に接着しており^6,7、B1細胞の割合はわずかです⁷。不確実性の領域はまだたくさんありますが、入手可能なデータは、B細胞がナイーブ心臓と損傷への心筋適応の文脈の両方で重要な役割を果たすことを示しています。

ナイーブマウス心臓での研究では、ベースライン時に心筋B細胞が主に血管内腔に位置し、内皮に接着していることが示されています(マウス心臓B細胞の>95%が血管内腔にあることがわかりました)。これらのB細胞は、末梢血から単離された循環B細胞のものとは異なる遺伝子発現パターンを有することがわかった。B細胞欠損動物および同系対照からのナイーブ心臓の分析は、B細胞を欠く動物がより小さく、駆出率が高いことを発見しました⁶。これらすべての証拠は、B細胞が心筋の成長および/または心筋機能を調節する可能性があり、間質性だけでなく血管内のB細胞もそのような観察の原因である可能性があることを示唆しています。B細胞は、心筋常在マクロファージの表現型を調節することも見出された⁸。

いくつかの研究は、B細胞が損傷に対する心筋適応の文脈において重要な役割を果たすことを示している⁸、^9、10、11、^12、13。B細胞は、おそらくCXCL13-CXCR5依存性機構を介して、損傷した心臓に一過性に蓄積する^11,13。そこから、B細胞は、サイトカインを介した単球の動員を含むいくつかのメカニズムを通じて、有害な心臓リモデリングを促進します^9,12。さらに、B細胞は、いくつかのメカニズムを介して心臓損傷の拡張および有害な心臓リモデリングを促進することができる心臓タンパク質に対する抗体を産生することができる14、¹⁵、16、^17、18、19、²⁰、^21、22、23、^24、25.B細胞はまた、IL-10¹⁰の分泌を介して損傷した心臓に保護効果を発揮することができる。

ナイーブで負傷した心臓におけるB細胞の役割を調査するグループの数が増えるにつれて、心筋B細胞を適切に定量および評価し、すでに文献に現れ始めている矛盾を回避するための共有プロトコルを定義することがますます重要になっています。これまでのところ、B細胞は実際にげっ歯類^の心臓7で最も一般的な免疫細胞の1つであり、骨髄系細胞よりも著しく低い有病率で存在すると報告されています^26,27、または非常にまれです²⁸。同様に、いくつかのグループは、急性虚血性心筋損傷後に心筋B細胞の数が増加すると記載している^7,9,13が、1つのグループは、損傷心筋のB細胞数に変化を報告しなかった²⁹。心臓免疫細胞の研究では、灌流条件の詳細が説明されることはめったになく、消化条件に関するコンセンサスはありません。げっ歯類の心臓ではB細胞の大部分が血管内であり、心筋からの免疫細胞の抽出は使用する消化方法に大きく依存するため、文献で報告されている違いは臓器灌流と組織消化の違いの結果である可能性があります。

ここでは、灌流および消化条件を最適化することでB細胞回収の収率を最大化し、血管内心筋B細胞と血管外心筋B細胞の識別を可能にする、マウス心筋B細胞のフローサイトメトリーベースの定量の詳細な方法を示します⁶。このプロトコルは、血管内免疫細胞と間質免疫細胞とを区別する他の類似のプロトコルの適応および最適化である²⁸、^30、31。

このプロトコルでは、心筋灌流を標準化して、微小血管内皮に接着した生物学的に関連するB細胞を除去することなく、血管内空間に浮遊するB細胞を排除します。さらに、血管内免疫細胞と間質免疫細胞を区別するための抗体の静脈内注射の使用を説明した以前のプロトコルに基づいて³²、B細胞が表面マーカーB220を発現するという事実を利用して³³、動物の犠牲および心臓灌流の直前にB220特異的抗体の血管内注射を通じて血管内心筋B細胞を区別する方法を示します。このプロトコルは、ナイーブで負傷した心臓の心筋B細胞の分析を含めることに関心のある科学者の研究に関連しています。このプロトコルの広範な実装は、研究グループ間の不一致を減らし、血管内および血管外の心筋B細胞プールの変化の分析を可能にし、したがって心臓免疫学の分野における発見の進歩を強化します。

要約すると、このプロトコルは、フローサイトメトリーを介して心筋B細胞を定量および分析すると同時に、血管外空間と血管内空間に位置する細胞を区別するための最適化されたワークフローを表しています。