Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

La microglía son las células inmunes residentes en el sistema nervioso central (SNC) y desempeñan un papel crucial en el desarrollo del SNC. La microglía también es importante en el cerebro adulto para mantener la homeostasis y responder activamente a los procesos de trauma y enfermedad. La evidencia acumulada muestra que la microglía es un contribuyente clave para la patogénesis de múltiples enfermedades neurodegenerativas y del desarrollo neurológico ^1,2. Aunque el conocimiento actual sobre la biología microglial se ha derivado predominantemente de modelos de ratón, estudios recientes han dilucidado diferencias importantes entre la microglía murina y humana, subrayando la necesidad de desarrollar tecnologías para estudiar la genética y las funciones biológicas de la microglía humana ^3,4. El aislamiento de la microglía del tejido primario disecado puede modificar gravemente las propiedades de la microglía⁵, lo que podría confundir los resultados adquiridos con tales células. El objetivo general de este método es diferenciar las iPSC humanas en iMG, proporcionando así un sistema de cultivo celular para estudiar la microglía humana en condiciones basales. Además, aquí se incluye un ensayo de fagocitosis utilizando un sistema modelo totalmente humano como un medio para estudiar la funcionalidad de los iMG, tanto como medida de control de calidad como para evaluar la disfunción de la MGI en el contexto de la enfermedad.

Múltiples protocolos para la diferenciación de microglia de iPSCs han surgido recientemente en la literatura 6,7,8,9,10. Las desventajas potenciales de algunos protocolos incluyen períodos prolongados o largos de diferenciación, la adición de múltiples factores de crecimiento y/o procedimientos experimentales complejos ^6,9,10. Aquí, se demuestra un método de diferenciación “fácil de usar” que recapitula aspectos de la ontogenia de la microglía a través de la diferenciación de iPSCs en células precursoras denominadas precursoras primitivas de macrófagos (PMPs)^7,11. Los PMP se generan como se describió anteriormente, con algunas optimizaciones presentadas aquí en¹². Los PMP imitan a los macrófagos derivados del saco vitelino independientes de MYB, que dan lugar a la microglía durante el desarrollo embrionario al invadir el cerebro antes del cierre de la barrera hematoencefálica¹³. Para diferenciar terminalmente las PMP en MGI, utilizamos un método de monocultivo rápido y simplificado basado en los protocolos de Haenseler et al. y Brownjohn et al., con algunas modificaciones para generar un método eficiente de diferenciación de microglia en el que los iMG expresan robustamente marcadores enriquecidos con microglía ^7,8. Este método de diferenciación se puede reproducir en laboratorios con experiencia en el cultivo de iPSCs y con objetivos de investigación destinados a estudiar la biología de la microglía utilizando un sistema modelo humano.

La microglía derivada de iPSC representa una fuente biológicamente relevante de microglía humana para la experimentación in vitro y es una herramienta importante para investigar las funciones canónicas microgliales, incluida la fagocitosis. La microglía son los fagocitos profesionales del cerebro y el SNC, donde limpian los desechos celulares, agregan proteínas y degradan la mielina¹⁴. La microglía también funciona en la remodelación sináptica por envolver sinapsis y en la defensa contra infecciones externas a través de fagocitosis de patógenos^15,16. En este protocolo, la fagocitosis por iMGs se evalúa utilizando sinaptosomas humanos como material para la absorción de iMG. Con este fin, se describe una descripción para aislar sinaptosomas derivados de LMNs humanos i³. Los sinaptosomas humanos derivados de i³LMN están marcados con un colorante sensible al pH que permite la cuantificación de sinaptosomas localizados dentro de compartimentos ácidos durante el procesamiento del fagosoma y la degradación in vitro. Se muestra un ensayo de fagocitosis utilizando microscopía de células vivas para monitorear el proceso dinámico de envolvimiento de microglia en tiempo real. Este ensayo funcional establece una base para investigar posibles defectos en la fagocitosis microglial en la salud y la enfermedad utilizando un sistema humano completo.