Cellule simili alla microglia umana: differenziazione da cellule staminali pluripotenti indotte e saggio di fagocitosi di cellule vive in vitro utilizzando sinaptosomi umani

Le microglia sono le cellule immunitarie residenti nel sistema nervoso centrale (SNC) e svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo del SNC. Le microglia sono anche importanti nel cervello adulto per mantenere l’omeostasi e rispondere attivamente ai traumi e ai processi patologici. Evidenze cumulative mostrano che le microglia sono fattori chiave per la patogenesi di molteplici malattie neuroevolutive e neurodegenerative ^1,2. Sebbene le attuali conoscenze sulla biologia microgliale siano state prevalentemente derivate da modelli murini, studi recenti hanno chiarito importanti differenze tra microglia murina, sottolineando la necessità di sviluppare tecnologie per studiare la genetica e le funzioni biologiche della microglia umana ^3,4. L’isolamento della microglia dal tessuto primario sezionato può modificare gravemente le proprietà della microglia⁵, potenzialmente confondendo i risultati acquisiti con tali cellule. L’obiettivo generale di questo metodo è quello di differenziare le iPSC umane in iMG, fornendo così un sistema di coltura cellulare per studiare la microglia umana in condizioni basali. Inoltre, un test di fagocitosi che utilizza un sistema modello completamente umano è incluso nel presente documento come mezzo per studiare la funzionalità delle iMG, sia come misura di controllo della qualità che per valutare la disfunzione di iMG nel contesto della malattia.

Protocolli multipli per la differenziazione delle microglia dalle iPSC sono recentemente emersi in letteratura 6,7,8,9,10. I potenziali svantaggi di alcuni protocolli includono lunghi o prolungati periodi di differenziazione, l’aggiunta di più fattori di crescita e/o procedure sperimentali complesse ^6,9,10. Qui viene dimostrato un metodo di differenziazione “user-friendly” che ricapitola aspetti dell’ontogenesi della microglia attraverso la differenziazione di iPSCs in cellule precursori denominate precursori primitivi dei macrofagi (PMP)^7,11. I PMP vengono generati come descritto in precedenza, con alcune ottimizzazioni presentate qui¹². I PMP imitano i macrofagi derivati dal sacco vitellino indipendenti da MYB, che danno origine alla microglia durante lo sviluppo embrionale invadendo il cervello prima della chiusura della barriera emato-encefalica¹³. Per differenziare terminalmente i PMP in iMG, abbiamo utilizzato un metodo di monocoltura veloce e semplificato basato sui protocolli di Haenseler et al. e Brownjohn et al., con alcune modifiche per generare un efficiente metodo di differenziazione della microglia in cui le iMG esprimono robustamente marcatori arricchiti di microglia ^7,8. Questo metodo di differenziazione può essere riprodotto in laboratori con esperienza nella coltura di iPSC e con obiettivi di ricerca volti a studiare la biologia delle microglia utilizzando un sistema modello umano.

Le microglia derivate da iPSC rappresentano una fonte biologicamente rilevante di microglia umana per la sperimentazione in vitro e sono uno strumento importante per studiare le funzioni canoniche microgliali, compresa la fagocitosi. Le microglia sono i fagociti professionali del cervello e del SNC, dove eliminano i detriti cellulari, le proteine aggregate e la mielina degradata¹⁴. Le microglia funzionano anche nel rimodellamento sinaptico inghiottendo le sinapsi e nella difesa contro le infezioni esterne attraverso la fagocitosi dei patogeni^15,16. In questo protocollo, la fagocitosi da parte di iMG viene valutata utilizzando sinaptosomi umani come materiale per l’inghiottimento di iMG. A tal fine, viene descritta una descrizione per isolare i sinaptosomi derivati da i³LMN umani. I sinaptosomi umani derivati da i³LMN sono marcati con un colorante sensibile al pH che consente la quantificazione dei sinaptosomi localizzati all’interno di compartimenti acidi durante l’elaborazione e la degradazione dei fagosomi in vitro. Viene mostrato un test di fagocitosi utilizzando la microscopia a cellule vive per monitorare il processo dinamico di inghiottimento della microglia in tempo reale. Questo test funzionale stabilisce una base per studiare possibili difetti nella fagocitosi microgliale in salute e malattia utilizzando un sistema umano completo.