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Biochemie

Evaluación rápida de la calidad de la proteína de membrana mediante cromatografía de exclusión de tamaño fluorescente

Published: January 06, 2023
doi:
10.3791/64322
, , ,
1Peak Proteins Ltd.

Summary

El presente protocolo describe un procedimiento para realizar cromatografía de exclusión de tamaño fluorescente (FSEC) en proteínas de membrana para evaluar su calidad para el análisis funcional y estructural posterior. Se presentan resultados representativos de FSEC recopilados para varios receptores acoplados a proteínas G (GPCR) en condiciones de solubilización detergente y sin detergente.

Abstract

Durante la elucidación estructural de la proteína de membrana y la caracterización biofísica, es común probar numerosas construcciones de proteínas que contienen diferentes etiquetas, truncamientos, deleciones, inserciones de socios de fusión y mutaciones estabilizadoras para encontrar una que no se agregue después de la extracción de la membrana. Además, la detección de tampón para determinar el detergente, aditivo, ligando o polímero que proporciona la condición más estabilizadora para la proteína de membrana es una práctica importante. La caracterización temprana de la calidad de la proteína de membrana mediante cromatografía de exclusión de tamaño fluorescente proporciona una herramienta poderosa para evaluar y clasificar diferentes construcciones o condiciones sin el requisito de purificación de proteínas, y esta herramienta también minimiza el requisito de muestra. Las proteínas de membrana deben ser marcadas fluorescentemente, comúnmente expresándolas con una etiqueta GFP o similar. La proteína puede solubilizarse directamente de células enteras y luego aclararse crudamente por centrifugación; Posteriormente, la proteína se transmite por una columna de exclusión de tamaño y se recoge un rastro fluorescente. Aquí, se presenta un método para ejecutar FSEC y datos representativos de FSEC sobre los objetivos GPCR del receptor de esfingosina-1-fosfato (S1PR1) y el receptor de serotonina (5HT2AR).

Introduction

La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), también conocida como cromatografía de filtración en gel, se usa comúnmente en la ciencia de proteínas1. Durante la SEC, las proteínas se separan en función de su radio hidrodinámico, que es una función del tamaño y la forma de la proteína2. En resumen, esta separación se logra aplicando las muestras de proteínas bajo flujo a un lecho empaquetado de perlas porosas que actúan como un tamiz molecular. Las perlas utilizadas son a menudo agarosa reticulada con un rango definido de tamaños de poro para permitir que las proteínas entren o se excluyan de los poros de las perlas 3,4,5,6,7. Las proteínas con radios hidrodinámicos más pequeños pasan una mayor proporción de tiempo dentro de los poros y, por lo tanto, fluyen a través del lecho empaquetado a un ritmo más lento, mientras que las proteínas más grandes pasan una mayor proporción de tiempo fuera de las perlas (el volumen excluido) y se mueven a través del lecho empacado a un ritmo más rápido. SEC se puede utilizar como un paso de purificación de proteínas cuando se utiliza una columna de preparación1. Cuando se utiliza una columna analítica, SEC se puede utilizar para analizar la calidad y las propiedades de la proteína2. Por ejemplo, los agregados de proteínas que pueden estar presentes en una muestra e indican proteínas de mala calidad tienden a ser muy grandes, lo que significa que solo viajan en el volumen excluido y, por lo tanto, se eluyen de la columna en el punto más temprano; Este volumen se denomina vacío de columna o volumen vacío. Además, se pueden utilizar patrones de peso molecular para calibrar la columna, lo que permite interpolar un peso molecular estimado de la proteína de interés a partir de una curva estándar.

Típicamente, la absorbancia de proteína a 280 nm se utiliza para monitorear la elución de proteínas desde una columna de exclusión de tamaño. Esto restringe el uso de SEC como herramienta de análisis hasta que la proteína de interés esté en gran medida libre de proteínas contaminantes, por ejemplo, en el último paso de la purificación de proteínas. Sin embargo, la SEC fluorescente (FSEC) utiliza una proteína de interés que está marcada con fluorescencia. Por lo tanto, una señal fluorescente puede ser utilizada para monitorear específicamente la elución de la proteína de interés en presencia de otras proteínas o incluso mezclas crudas 8,9. Además, como las señales fluorescentes son altamente sensibles, se puede realizar un análisis exitoso en muestras con cantidades de proteínas extremadamente bajas. La proteína de interés a menudo se marca fluorescentemente al incluir una proteína fluorescente verde (GFP) o una etiqueta GFP mejorada (eGFP) en el constructo de expresión. La señal fluorescente puede ser monitoreada por excitación a 395 nm o 488 nm y detectando la emisión fluorescente a 509 nm o 507 nm para GFP o eGFP, respectivamente10.

El beneficio de usar una señal fluorescente para monitorear la elución de proteínas desde una columna SEC hace que FSEC sea una herramienta valiosa para analizar muestras de proteínas de membrana cuando los niveles de expresión son particularmente pobres en comparación con las proteínas solubles. Fundamentalmente, la calidad y las propiedades de las proteínas de membrana se pueden analizar directamente después de la solubilización a partir de lisados crudos sin el requisito de optimizar primero el proceso de purificación11,12. Por estas razones, FSEC se puede utilizar para analizar rápidamente la calidad de la proteína de membrana mientras se exploran los diferentes factores que pueden ser necesarios para mejorar el comportamiento de la proteína de membrana en solución. Por ejemplo, es común probar numerosas construcciones que contienen diferentes etiquetas, truncamientos, deleciones, inserciones de socios de fusión y mutaciones estabilizadoras para encontrar una que no se agregue después de la extracción de la membrana13,14. Además, la detección tampón para determinar el detergente, aditivo, ligando o polímero que proporciona la condición más estabilizadora para la proteína de membrana puede definir la mejor composición tampón para la purificación de proteínas o para proporcionar estabilidad para usos posteriores, como ensayos biofísicos o caracterización estructural.

Por lo tanto, el objetivo general del método FSEC es recopilar un perfil de elución en columna SEC para una proteína de membrana diana de interés. Además, a medida que se utiliza la fluorescencia, esta traza SEC se recoge en el punto más temprano posible en la optimización de las construcciones y condiciones antes de cualquier purificación prolongada. La traza FSEC se puede utilizar como una herramienta comparativa para juzgar la probabilidad de éxito de purificar una proteína de membrana con diferentes condiciones de tampón o construcciones de proteínas de membrana. De esta manera, la colección de perfiles FSEC se puede utilizar como un proceso iterativo rápido para llegar a un diseño de construcción óptimo y composición de tampón antes de gastar esfuerzo generando las cantidades de proteína pura requeridas para otros métodos de análisis.

Protocol

1. Detergente y preparación tampón para FSEC Prepare una solución madre de detergente.Para preparar una solución madre de 20 ml, pese 4 g de polvo de maltósido de dodecilo (DDM) y 0,4 g de polvo de hemisuccinato de colesterilo (CHS) y llegue a 20 ml conH2Odestilado de grado de laboratorio. Después de agregar todos los componentes, mezclar con la inversión de extremo a extremo a 4 °C hasta que los componentes estén completamente solubilizados. Se recomienda la mezcla nocturna de extremo a extremo a 4 °C. Alícuota y conservar las existencias de detergente a −20 °C hasta su uso. Si es necesario utilizar el material inmediatamente, guarde el stock de detergente en hielo.NOTA: El stock de detergente estándar utilizado en este trabajo fue una mezcla de DDM al 20% (p/v) y una mezcla de CHS del 2% (p/v) (ver Tabla de materiales). Se pueden usar diferentes detergentes (por ejemplo, lauril maltosa neopentil glicol; LMNG), o el uso de extracción sin detergente con polímeros como el ácido estireno-maleico (SMA) se puede probar. Esto debe decidirse al diseñar las condiciones experimentales que se van a probar. Prepare un tampón de solubilización.Prepare un tampón de solubilización combinando el peso o volumen correcto de los componentes para lograr una concentración final de 100 mM de HEPES, 200 mM de NaCl, 20 % (v/v) de glicerol y 1x cóctel de inhibidores de proteasa (consulte la Tabla de materiales) en un vaso de precipitados.NOTA: En el presente estudio, la preparación de 50 mL de tampón de solubilización fue suficiente para procesar cinco muestras. Agregue un volumen de 0.7 (por ejemplo, 35 ml si se hacen 50 ml de tampón) deH2Odestilado de grado de laboratorio al vaso de precipitados. Mezclar en un agitador magnético, y usando un medidor de pH, ajustar el pH tampón a 7.5 mediante la adición gota a gota de NaOH concentrado. Usando un cilindro de medición, rellene el tampón hasta el volumen final requerido con H2O destilado de grado de laboratorio. Prepare el búfer de ejecución de la SEC.Prepare el tampón de funcionamiento SEC combinando el peso o volumen correcto de los componentes para lograr una concentración final de 100 mM de HEPES, 150 mM de NaCl y 10% (v/v) de glicerol en un vaso de precipitados.NOTA: En el presente estudio, la preparación de 600 ml de tampón SEC fue suficiente para ejecutar cinco muestras. Agregue un volumen de 0.7 (por ejemplo, 420 ml si se hacen 600 ml de tampón) deH2Odestilado de grado de laboratorio al vaso de precipitados. Mezclar en un agitador magnético, y usando un medidor de pH, ajustar el pH tampón a 7.5 mediante la adición gota a gota de NaOH concentrado. Usando un cilindro de medición, rellene el tampón hasta el volumen final requerido con H2O destilado de grado de laboratorio. Filtre el tampón SEC a través de un filtro poroso de 0,45 μm con tapa de botella al vacío (consulte la Tabla de materiales). Una vez que el tampón haya pasado por el filtro, desgasifique dejándolo al vacío hasta que no aparezcan más burbujas cuando se agite. Agregue una concentración final de 0.03% (p/v) DDM y 0.003% (p/v) CHS al tampón SEC agregando el volumen requerido del stock de detergente preparado en el paso 1 (por ejemplo, 0.9 ml si se hacen 600 ml de tampón SEC). Enfríe previamente el tampón antes de usarlo.NOTA: Se pueden utilizar diferentes búferes dependiendo de las condiciones probadas. Por ejemplo, si se prueba el efecto de diferentes detergentes en la proteína de interés, idealmente se necesitaría hacer un tampón con el mismo detergente que el utilizado para solubilizar la proteína. Si se prueban condiciones sin detergente con SMA, el detergente debe omitirse completamente del tampón SEC. Sin embargo, consulte la sección de discusión para obtener más detalles sobre las modificaciones del protocolo para el cribado de detergentes. 2. Preparación de muestras para FSEC Preparar los gránulos celulares.NOTA: El punto de partida para el ensayo es la recolección del pellet celular de un cultivo de expresión celular en suspensión de la proteína de interés marcada con GFP (u otra proteína marcada con fluorescencia). Los tiempos y condiciones exactos para la cosecha dependerán de la proteína que se expresa, la línea celular que se utiliza, las condiciones en las que se han cultivado las células y el método por el cual se ha inducido la expresión de proteínas. Estos detalles están más allá del alcance de este protocolo. En este estudio, se utilizaron 0,5-1 g de pellet de células Sf21 por condición a probar, correspondiente a 25-50 mL de cultivo 2-3 días después de la infección con aproximadamente 4 x 106 células viables/mL de una dilución 1:20 de baculovirus P2. Tenga en cuenta que el protocolo descrito aquí ha sido probado y se ha encontrado que funciona igualmente bien con pesos húmedos similares de pellets celulares de otras líneas celulares eucariotas (por ejemplo, HEK293E).Cuando las células de los cultivos en suspensión estén listas para cosechar, transfiera 25-50 ml de alícuotas de cultivo a tubos cónicos de 50 ml. Contrapesar los tubos y usar una centrífuga de sobremesa en un cubo abatible (consulte la Tabla de materiales) a 2.000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente para granular las celdas. Retire y deseche el sobrenadante de cultivo volcándolo suavemente, o use una pipeta de 50 ml con un relleno de pipetas si el pellet de celda está particularmente suelto. Si las células se van a utilizar inmediatamente para el análisis, coloque el pellet de células en hielo y continúe directamente con el paso 5. Si las células se van a guardar para su uso en una fase posterior, congelar las células colocándolas a -80 °C. Si el pellet de la celda se ha almacenado a -80 °C, descongélelo rápidamente incubándolo a temperatura ambiente durante 15 minutos o hasta que la muestra ya no esté congelada. Mueva la muestra inmediatamente al hielo siguiendo este paso. Resuspender y solubilizar la muestra.Añadir 2 ml del tampón de solubilización (paso 1.2) al pellet celular. Incubar con inversión de extremo a extremo a 4 °C durante 15-30 min hasta que sea homogéneo. Añadir el stock de detergente premezclado (paso 1.1) (por ejemplo, 100 μL de existencias de DDM al 20 %/CHS al 2 %) para obtener una concentración final de 1 % de DDM/0,1 % de CHS. Solubilizar durante 30 min con inversión de extremo a extremo a 4 °C.NOTA: Si es deseable, se pueden probar múltiples condiciones en paralelo. El número de muestras paralelas que se pueden procesar a la vez dependerá del sistema disponible para ejecutar el experimento SEC. En la configuración descrita aquí, era posible procesar hasta cinco muestras a la vez. Realice un paso de centrifugación a baja velocidad.Centrifugar la muestra en una centrífuga de sobremesa preenfriada (4 °C) en un cubo abatible a 2.000 x g durante 15 min. Realice un paso de centrifugación de alta velocidad.Transfiera cuidadosamente el sobrenadante de la centrifugación de baja velocidad a tubos de ultracentrifugación (por ejemplo, tubos de 0,5-2 ml) utilizando una aguja roma conectada a una jeringa de 5 ml, teniendo cuidado de no perturbar el pellet del centrifugado a baja velocidad. Equilibre los pares de tubos dentro de 0,05 g y colóquelos en un rotor de ultracentrifugación de ángulo fijo (consulte la Tabla de materiales). Centrifugar a 4 °C durante 30 min a 250.000 x g. 3. Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) Prepare el sistema de cromatografía líquida de proteínas rápidas (FPLC) y equilibre la columna.Prepare el sistema siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales), por ejemplo, llenando el sistema con tampón SEC y purgando las bombas de aire. Conecte la columna SEC al FPLC, asegurándose de que no entre aire en la columna. Esto se logra aplicando contrapresión a la columna SEC con una jeringa llena de agua (unida a la parte inferior de la columna) para realizar una conexión gota a gota con la ruta de flujo del sistema FPLC. Preequilibre la columna SEC lavándola primero en volúmenes de 1,5 columnas (36 ml para una columna de 24 ml) de H2O destilado y filtrado de grado de laboratorio, seguido de volúmenes de 1,5 columnas de tampón SEC al caudal y presión recomendados para la columna (consulte la Tabla de materiales).NOTA: El sistema FPLC utilizado en este estudio para realizar FSEC estaba en un ambiente frío y tenía una válvula de bucle de cinco posiciones y un colector de fracción de placa de seis posiciones instalado. Esta configuración permite cargar cinco muestras y ejecutarlas secuencialmente por la misma columna de forma automatizada sin necesidad de intervención manual entre las ejecuciones. Para ejecutar los experimentos SEC, se utilizó una columna preempaquetada de 24 ml disponible comercialmente (ver Tabla de materiales), que contenía una resina que permitía resolver proteínas en el rango de peso molecular de 10-600 kDa. Si la proteína de interés es particularmente grande, se podría usar una matriz de columna alternativa en su lugar, permitiendo la separación de proteínas de hasta 5.000 kDa en peso molecular. Tenga en cuenta que la presencia de micelas detergentes / lípidos aumentará el tamaño total de la proteína de membrana en > 150 kDa, dependiendo de la proteína y el detergente utilizados. Aplique el ejemplo a la columna y ejecute el experimento SEC.Transfiera el sobrenadante de la etapa de centrifugación de alta velocidad a una jeringa de 1 ml utilizando una aguja roma conectada a la jeringa. Esto permite la recuperación de la muestra del tubo de centrífuga sin alterar el pellet. Establezca el bucle de ejemplo para cargar. Llene un bucle de muestra de 500 μL inyectando 600-700 μL de la muestra de la jeringa en el puerto de carga. Dependiendo del sistema utilizado, este paso de carga se puede programar en el método para garantizar que no se cometan errores. Durante el método, inyecte la muestra del bucle en la columna vaciándola con 4 ml de tampón SEC al caudal y la presión recomendados para la columna (consulte la Tabla de materiales). Ejecute la columna al mismo caudal hasta que 1,5 volúmenes de columna (36 ml para una columna de 24 ml) del búfer hayan pasado. A 0.25 del volumen de la columna (6 ml para una columna de 24 ml), comience a recolectar fracciones de 0.2 ml para recolectar 90 fracciones.NOTA: Como se espera que el volumen vacío de la columna sea de 0,3 volúmenes de columna, el comienzo de la recolección de fracciones inmediatamente antes de esto asegura que se monitoree la elución de toda la proteína, incluida cualquier proteína presente en el volumen vacío. 4. Recolección y análisis de trazas fluorescentes Transfiera las muestras del colector de fracciones (paso 3.2.5) a una placa de 96 pocillos y lea la señal fluorescente.Antes de tomar una lectura de fluorescencia, diluya las muestras recolectadas. Utilizando una pipeta multicanal, transfiera 90 μL deH2Odestilado de grado de laboratorio desde un depósito a cada pocillo de una placa opaca de fondo plano de 96 pocillos (consulte la Tabla de materiales). Si las fracciones se recogieron en un bloque de 96 pocillos durante el paso 3.2.5, utilice una pipeta multicanal para transferir 10 μL de las fracciones SEC del bloque a la placa opaca de fondo plano de 96 pocillos, y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. De lo contrario, si las fracciones SEC se recogieron en tubos individuales durante el paso 3.2.5, transfiera 10 μL de cada fracción a la placa opaca de fondo plano de 96 pocillos una por una, pipeteando hacia arriba y hacia abajo cada vez para mezclar las muestras. Coloque la placa opaca de fondo plano de 96 pocillos en el lector de placas y mida la fluorescencia. Si GFP es la etiqueta fluorescente (utilizada aquí), ajuste la excitación lo más cerca posible de 488 nm y detecte la emisión fluorescente lo más cerca posible de 507 nm.NOTA: La dilución requerida antes de tomar la lectura de fluorescencia dependerá de la cantidad total de proteína de interés presente en el cultivo de expresión y la sensibilidad del lector de placas que se está utilizando. En los ejemplos mostrados en este estudio, las muestras se diluyeron 10 veces en agua. Como sugerencia para un punto de partida, las fracciones deben diluirse 5-10 veces en agua o tampón antes de la detección. Si la señal de traza FSEC registrada es particularmente baja, se pueden usar diluciones más pequeñas o incluso una muestra sin diluir. El dispositivo utilizado para la detección en este estudio fue un lector de placas capaz de excitar a 488 nm y detectar emisiones fluorescentes a 507 nm (ver Tabla de materiales). Trazar las trazas de FSEC.Exporte los datos del lector de placas en un formato sin formato (texto sin procesar o un archivo de valores separados por comas). Estos datos brutos se trazarán en el eje Y de la traza FSEC. Para el eje X, calcule el volumen en el que se recolectó cada fracción. El primer pocillo debe ser el volumen de elución en el que se recolectó la primera fracción para tener en cuenta el retraso de fraccionamiento (6 ml en este ejemplo). Las fracciones después de esto deben aumentar secuencialmente en el volumen de fracción recolectada (0.2 ml en este ejemplo). Una vez que se hayan calculado los datos del eje X y del eje Y, copie y pegue los datos en el software gráfico (consulte la Tabla de materiales) para trazar la señal fluorescente en cada pozo contra el volumen al que eluyó de la columna.NOTA: La figura 1 muestra una representación esquemática de los pasos necesarios para ejecutar un experimento FSEC. Analizar las trazas FSEC.Evalúe la cantidad de elución de proteínas en el volumen vacío (aproximadamente 8 ml para una columna de 24 ml), lo que indica que la proteína es muy grande en tamaño y es probable que se despliegue / agregue. Evalúe la cantidad de proteína que libera en cualquier pico posterior, que indique proteína plegada. Se espera que esto esté entre 10 ml y 16 ml para una columna de 24 ml dependiendo del tamaño de la proteína (cuando se asocia con una micela detergente / lípida). Preste mucha atención a la forma del pico, especialmente si se trata de un pico ancho o dividido que abarca más de 3-4 ml (para una columna de 24 ml), ya que esto indica una muestra polidispersa. Calcule la relación entre la altura del pico monomérico y la altura del pico del vacío dividiendo la señal máxima registrada en el pico del monómero por la señal máxima en el pico del vacío.NOTA: Este valor representa el índice de monodispersidad y permite una medida cuantitativa de la calidad de la proteína; Los valores más grandes indican la mejor calidad posible, mientras que los valores inferiores a 1 indican muestras problemáticas, ya que tienen más proteínas agregadas que proteínas plegadas. Si se van a comparar varias ejecuciones FSEC y la característica más importante es la cantidad de monómero en cada caso, trace las trazas como la señal sin procesar registrada por el lector de placas (por ejemplo, RFU).NOTA: Si una comparación de la cantidad de monómero en comparación con la proteína desplegada es más importante, la señal debe normalizarse a un porcentaje de la señal total utilizando las lecturas mínimas y máximas en la traza, lo que acentuará las diferencias en la relación entre la proteína agregada y monomérica entre las trazas. Figura 1: Representación esquemática de los pasos necesarios para ejecutar un experimento FSEC. (1) Las células que expresan la proteína de interés marcada con fluorescencia se solubilizan. (2) La solubilización cruda se aclara primero con un giro de baja velocidad, seguido de (3) un giro de alta velocidad. (4) El sobrenadante de muestra aclarado se carga y ejecuta en una columna SEC apropiada, y (5) se recogen las fracciones. (6) Las muestras de las fracciones se transfieren a una placa de 96 pocillos, y se detecta una señal fluorescente GFP utilizando un lector de placas para (7) trazar la traza FSEC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representative Results

En primer lugar, se investigó el rango dinámico y los límites inferiores de detección de eGFP para el lector de placas utilizado en este estudio. Un estándar purificado de eGFP de concentración conocida se diluyó en un volumen final de 50 μL a 50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12.5 ng·μL−1, 6.25 ng·μL−1, 3.125 ng·μL−1, 1.5625 ng·μL−1, 0.78125 ng·μL−1 y 0.390625 ng·μL−1, y la fluorescencia se leyó usando una excitación de 488 nm y una emisión de 507 nm (Figura 2 ). Este experimento indicó que el lector de placas tenía un límite de detección inferior de 30 ng de proteína marcada con eGFP por pocillo y un rango dinámico de hasta 500 ng de proteína marcada con eGFP por pocillo antes de la saturación de la señal. Usando el valor para el límite inferior y suponiendo que la elución de proteínas se limita a 0.33 del volumen de la columna, se requiere tan solo 1.28 μg de proteína de interés marcada con eGFP para que se observe una señal FSEC detectable. Figura 2: Curva estándar eGFP. Gráfico de dispersión de la señal fluorescente para el estándar eGFP purificado diluido a 50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12.5 ng·μL−1, 6.25 ng·μL−1, 3.125 ng·μL−1, 1.5625 ng·μL−1, 0.78125 y 0.390625 ng·μL−1. (A) Se muestran todas las diluciones, incluidas aquellas con la señal saturada. (B) Un gráfico de dispersión ampliado que incluye solo los estándares que caen en el rango dinámico del lector de placas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. En segundo lugar, la columna de 24 ml utilizada para este estudio se calibró con estándares de peso molecular. Utilizando las mismas condiciones de tampón y funcionamiento que se utilizaron para el análisis FSEC, los patrones de peso molecular dextrano azul (>2.000 kDa), ferritina (440 kDa), aldolasa (158 kDa), conalbúmina (75 kDa) y ovoalbúmina (43 kDa) se inyectaron individualmente y se ejecutaron a través de la columna, y se recogieron trazas de elución con una absorción de 280 nm. Los volúmenes de elución registrados fueron 8,9 mL, 12,4 mL, 15,2 mL, 16,9 mL y 18 mL, respectivamente. Cuando estos volúmenes de elución se convirtieron a Kav (Ecuación 1) y se trazaron contra pesos moleculares logarítmicos, se pudo ajustar una curva estándar. Esto permitió estimar el peso molecular de los GPCR probados en este estudio mediante interpolación de la curva estándar (Figura 3). Por ejemplo, la traza FSEC del receptor de serotonina GPCR 2A (5HT2AR) después de la solubilización en el detergente DDM indicó un volumen de elución de 13,4 ml. Este volumen de elución 5HT2AR se encuentra entre los volúmenes de elución registrados para ferritina y aldolasa y proporciona un peso molecular estimado de aproximadamente 300 kDa. La construcción 5HT2A R utilizada en este estudio es de aproximadamente 50 kDa (incluida la etiqueta eGFP), lo que significa que si se supone que 5HT2AR es monomérico, se podrían atribuir 250 kDa de peso molecular a la micela detergente / lípido DDM. La ecuación para la conversión de volúmenes de elución es la siguiente (Ecuación 1): (Ecuación 1) donde V e es el volumen de elución, V 0 es el volumen vacío de la columna y Vc es el volumen total de la columna. Figura 3: Curva de calibración de la columna SEC utilizando estándares de peso molecular. (A) Una traza FSEC representativa de 5HT 2A R solubilizada en DDM, con las posiciones relativas de elución de los patrones de peso molecular dextrano azul (Void), ferritina, aldolasa, conalbúmina y ovoalbúmina marcadas. La ferritina, la aldolasa, la conalbúmina y la ovoalbúmina están coloreadas en verde, púrpura, rojo y cian, respectivamente. (B) La curva de calibración del peso molecular utilizando las posiciones de elución de los patrones después de la conversión a Kav (Ecuación 1) trazada contra el peso molecular logarítmico (Mr). El Mr de 5HT2AR en DDM se interpoló a partir de la curva usando Kav y se muestra en la curva (cuadrado azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. A continuación, se utilizó FSEC para evaluar la calidad y las propiedades del receptor GPCR de esfingosina-1-fosfato (S1PR1)15. Las células de insectos que expresan S1PR 1 humano marcado con GFP se procesaron para FSECcomo se describe en el protocolo (Figura 1). En primer lugar, se exploraron las condiciones óptimas de extracción por membrana probando los detergentes DDM y LMNG contra la extracción sin detergente con SMA (Figura 4A). El índice de monodispersidad se utilizó para evaluar la calidad de la muestra de proteína y la relación entre la proteína en el vacío (~8 ml de retención de columna) en comparación con la muestra monodispersa (retención de columna de 14-15 ml). La muestra solubilizada en LMNG mostró un perfil FSEC superior con una mejor forma de pico de monómero y un pico de agregado de proteína más bajo, lo que indica que la solubilización y purificación en LMNG fueron las condiciones más estabilizadoras para esta proteína de membrana. En contraste, la muestra solubilizada en DDM tuvo un perfil FSEC relativamente más pobre, con un pico agregado más grande y un pico monomérico más amplio, lo que indica polidispersidad en la muestra. En segundo lugar, se investigó el efecto de la adición de ligando en el perfil FSEC mediante la adición de esfingosina-1-fosfato (S1P) a la muestra durante la solubilización. En este caso, se utilizó DDM como reactivo de solubilización, y se compararon las trazas FSEC de S1PR1 en presencia y ausencia de S1P (Figura 4B). La muestra solubilizada en presencia de S1P mostró una traza FSEC superior con agregación reducida. Esto indicó que la purificación en presencia de un ligando era ventajosa para mejorar la calidad de la muestra de proteína al estabilizar el receptor en solución, pero también era ventajosa también como marcador sustituto de la actividad proteica, ya que los resultados sugirieron que la proteína estaba correctamente plegada y era competente para la unión del ligando. Figura 4: FSEC utilizando un extracto crudo de S1PR 1 que indica las condiciones óptimas de extracción por membrana y unión de ligandos. (A) Comparación de las trazas FSEC de S1PR1 solubilizado en copolímero de estireno-ácido maleico (SMA; azul), lauril maltosa neopentil glicol (LMNG; rojo) o dodecil maltósido (DDM; negro). (B) Comparación de las trazas FSEC de S1PR 1 solubilizadas en DDM en presencia (rojo) o ausencia (negro) del agonista esfingosina-1-fosfato (S1P). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. FSEC también se utilizó para investigar la estabilidad a largo plazo de 5HT2AR en diferentes condiciones. El 5HT2AR humano marcado con GFP se solubilizó a partir de membranas celulares de insectos en detergente (DDM) o polímero SMA y se analizó mediante FSEC en varios puntos de tiempo después del almacenamiento a 4 °C o temperatura ambiente (Figura 5). Después de varios días de incubación, 5HT2AR en DDM mostró una caída significativa en la altura del pico monomérico a cualquiera de las temperaturas, y se observaron aumentos significativos en el pico agregado. En contraste, 5HT2AR en partículas lipídicas SMA (SMALP) no mostró una caída significativa en la altura del pico monomérico en el transcurso del experimento, lo que indica que la proteína en SMALP permaneció estable durante más tiempo, incluso a temperaturas desfavorables. Esto puede ser importante cuando se consideran preparaciones de proteínas para aplicaciones biofísicas posteriores, como experimentos de resonancia de plasmones de superficie (SPR) para los cuales existe el requisito de que la muestra sea estable y activa durante un largo período de tiempo para completar con éxito los experimentos de unión. Figura 5: Efecto del tiempo y la temperatura sobre la calidad de 5HT 2A R extraído de la membrana utilizando DDM o SMALP, según lo analizado por FSEC. (A) Trazas representativas de FSEC de 5HT2AR solubilizadas en DDM y almacenadas a temperatura ambiente durante 1 día (gris), 2 días (verde) o 5 días (azul). (B) Histogramas de la altura máxima monomérica normalizada para muestras DDM almacenadas a 4 °C (azul) o RT (verde) en comparación con muestras SMALP almacenadas a 4 °C (gris) o RT (negro). Las barras de error son representativas del SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los enfoques sistemáticos genéricos para la detección de condiciones con FSEC que se presentan aquí permiten la rápida optimización de los parámetros de solubilización y purificación para la producción de proteínas de membrana. Esto significa que las proteínas de membrana estables y funcionalmente activas se pueden producir rápidamente para estudios biofísicos y estructurales. Además, FSEC se puede ejecutar utilizando equipos de laboratorio que probablemente ya estén en su lugar en los laboratorios de proteínas de membrana y, por lo tanto, no hay ningún requisito para la compra de un instrumento especializado para ejecutar los ensayos.

Pasos críticos
El tiempo transcurrido entre el punto de solubilización de las células en detergente y el punto en que la muestra se pasa por la columna SEC (pasos 2.1.5-3.2.5) es crítico en el tiempo, y no debe haber pausas entre estos pasos. Todos los pasos deben realizarse a 4 °C o en hielo, y el tiempo necesario para realizar estos pasos debe mantenerse al mínimo posible. Estas restricciones de tiempo y temperatura son necesarias para registrar el perfil FSEC para la proteína de membrana antes de cualquier posible despliegue o degradación. Después de que la proteína de membrana ha sido solubilizada, existe un mayor riesgo de despliegue, agregación y degradación, incluso a 4 °C. Idealmente, cualquier muestra para la que se vayan a comparar las trazas FSEC debe pasar por la columna SEC en el mismo período de tiempo después de la etapa de solubilización. En la práctica, esto es difícil, especialmente si las muestras se pasan secuencialmente por una sola columna, pero es posible recolectar hasta cinco trazas SEC dentro de las 3 h entre sí, y en este período de tiempo, no debería haber una degradación significativa.

Solución de problemas
Si, al realizar el experimento FSEC, hay poca o ninguna señal fluorescente, es posible que la proteína de membrana de interés no haya expresado la línea celular elegida, tenga una expresión muy baja de la línea celular elegida o no haya sido solubilizada en el detergente elegido. Si las muestras se diluyeran antes de recoger la señal de fluorescencia y registrar la traza FSEC, un primer paso simple sería probar una dilución menor o ninguna dilución de las fracciones SEC. Si esto aún no produce una traza FSEC interpretable, se debe verificar la expresión y solubilización de la proteína.

El análisis de la expresión de proteínas puede lograrse comprobando la fluorescencia de la muestra después del paso 2.2.2. Si hay una señal fluorescente muy baja o nula de esta muestra (por ejemplo, una señal muy cerca del fondo), es probable que haya un problema con la expresión de la proteína. Se pueden tomar medidas para mejorar los niveles de expresión de la proteína de membrana, como cambiar a una línea celular alternativa o ajustar las condiciones de crecimiento, la inducción de la expresión y el tiempo entre la inducción / infección / transfección y la cosecha. Sin embargo, una expresión de proteínas particularmente pobre puede indicar una proteína de membrana inestable y, por lo tanto, una mala elección de constructo.

Si se ha comprobado la expresión y hay una señal fluorescente clara sobre el fondo antes de la FSEC, la eficacia de solubilización puede comprobarse midiendo la señal fluorescente restante de la muestra después del paso 2.4.3 (proteína de membrana soluble) en comparación con la muestra después del paso 2.2.2 (proteína total). Es común que la eficiencia de solubilización sea del 20% -30% y aún permita el análisis exitoso y la purificación de la proteína de membrana. Sin embargo, si la eficiencia de solubilización es inferior al 20%, puede ser necesario un detergente diferente para la solubilización o diferentes condiciones de solubilización. Si los intentos de mejorar la solubilización no tienen éxito, esto puede indicar una proteína de membrana particularmente inestable y, por lo tanto, una mala elección de constructo.

Si se observa un pico de elución muy tardío en la traza FSEC (por ejemplo, 18-24 ml), esto indica que la proteína fluorescente tiene un peso molecular de proteína que es mucho menor de lo esperado. Esto puede ser causado por la degradación de la proteína de membrana de interés, lo que resulta en GFP “libre”. Se debe comprobar si la proteína está intacta antes y después de la solubilización utilizando fluorescencia GFP en gel. Si la proteína de interés parece estar degradándose o proteolizada, la cantidad de inhibidor de la proteasa puede aumentarse de dos a cuatro veces. Sin embargo, una alta sensibilidad a las proteasas o proteínas degradadas incluso antes de la solubilización puede indicar una proteína particularmente inestable y, por lo tanto, una mala elección de constructo.

Modificaciones y otras aplicaciones de FSEC
Comúnmente, la etiqueta fluorescente que se utiliza en FSEC es GFP o eGFP, como se describe en este protocolo. Sin embargo, hay muchas etiquetas de proteínas fluorescentes diferentes disponibles. La elección de la etiqueta fluorescente que se utilizará depende de tener un lector de placas que pueda lograr los parámetros correctos de excitación y emisión para registrar la señal fluorescente para la etiqueta fluorescente seleccionada y tener un fluoróforo con poco o ningún cambio en el rendimiento cuántico en diferentes condiciones ambientales. Además, FSEC no se limita a proteínas fluorescentes, sino que también puede funcionar igualmente bien con una proteína que ha sido marcada con un tinte fluorescente. Por ejemplo, se podría usar un colorante NTA, que se uniría favorablemente a las construcciones de proteínas de membrana marcadas con histidina. Además, un anticuerpo marcado con fluorescencia marcado químicamente con un colorante fluorescente y específico para unirse a la proteína de membrana de interés o una etiqueta de purificación incluida en la construcción de la proteína de membrana podría etiquetar indirectamente un objetivo para FSEC.

Al realizar el cribado de detergente utilizando FSEC, se puede elegir si el tampón utilizado para ejecutar la columna SEC debe contener el detergente correspondiente en el que se ha solubilizado la proteína o si se debe usar un detergente estándar en todas las corridas. Se obtendrá una representación más precisa del comportamiento de la proteína si todo el experimento se realiza con el detergente correspondiente en todo momento. Sin embargo, puede llevar mucho tiempo y desperdiciar detergente si la columna debe reequilibrarse en un nuevo detergente antes de que se lleve a cabo cada ejecución. Además, como el objetivo principal del cribado con detergente es comparar trazas, las tendencias permanecerán en las trazas incluso si las condiciones no son ideales. Por lo tanto, se puede llegar a un compromiso por el cual la proteína se solubiliza en el detergente de interés, pero la columna se ejecuta en un tampón estándar con un solo detergente en todas las series (por ejemplo, DDM)11, lo que puede ahorrar tiempo y consumibles de detergente.

Al modificar el equipo FLPC utilizado, el rendimiento del protocolo FSEC se puede aumentar significativamente y se puede minimizar el requisito de muestra. Por ejemplo, un sistema FPLC o HPLC podría equiparse con un muestreador automático, una columna analítica de volumen de lecho más pequeña (como una columna SEC analítica de 3,2 ml) y un detector fluorescente en línea para monitorear trazas FSEC continuas directamente desde la columna. La configuración resultante permitiría realizar más ejecuciones FSEC en un período de tiempo más corto y eliminaría el paso de trazado manual, lo que permitiría probar un mayor número de condiciones en un marco de tiempo más corto. Además, el requisito de muestra se reduciría aún más, ya que habría que preparar y cargar menos muestras en la columna FSEC para cada ejecución. Esto abriría posibilidades para reducir las culturas de expresión a un formato basado en placas, ya que se requeriría tan poco material para el análisis.

Fortalezas y debilidades de la FSEC en comparación con otros métodos
Una desventaja de FSEC es que las construcciones de proteínas de membrana deben diseñarse para introducir la etiqueta fluorescente, y en la introducción, existe una pequeña posibilidad de que la colocación de la etiqueta pueda interferir con la función o el plegamiento de la proteína de membrana de interés. Además, el protocolo FSEC, como se describe aquí, monitorea las características de una proteína de membrana en presencia de lisado celular, que es una mezcla cruda de proteínas. El comportamiento de una proteína de membrana en este ambiente puede ser diferente que cuando la proteína de membrana de interés se somete a una columna SEC preparativa al final de la purificación cuando está completamente aislada de otras proteínas. Además, FSEC proporciona una medida algo cualitativa de la calidad de la proteína. Sin embargo, al convertir la traza FSEC en un índice de monodispersidad, como se describe en el paso 4.3.3 del protocolo, se puede obtener una medida cuantitativa de la calidad de la proteína.

FSEC no es el único método que se puede utilizar en el análisis temprano de construcciones de proteínas de membrana, condiciones de solubilización y composición de tampón de purificación. Los enfoques alternativos tienen ventajas y desventajas sobre FSEC. Por ejemplo, existen ensayos de termoestabilidad basados en fluoróforos, particularmente el uso del colorante 7-dietilamino-3-(4′-maleimidylphenyl)-4-methylcumarina (CPM)16,17. La ventaja de este método es que, a diferencia de FSEC, que proporciona una medida cualitativa de la calidad de la proteína, los ensayos de termoestabilidad proporcionan una medida cuantitativa en forma de una temperatura de fusión relativa. Además, no es necesario introducir una etiqueta fluorescente en la construcción de la proteína. Sin embargo, las desventajas de los ensayos de termoestabilidad en comparación con FSEC son que se debe usar proteína purificada y que el ensayo no es compatible con todas las construcciones de proteínas, ya que se basa en las posiciones ventajosas de los residuos de cisteína nativa en la proteína plegada.

Otro método que tiene similitudes con FSEC y ensayos de termoestabilidad basados en fluoróforos es un ensayo que mide la sensibilidad a la temperatura de una proteína de membrana. En este ensayo, la proteína se desafía con diferentes temperaturas, y se detecta la proteína que permanece en solución después de la centrifugación. La detección en este método se ha llevado a cabo de varias maneras, incluida la medición de la fluorescencia en la solución18, la fluorescencia de una banda de gel SDS-PAGE19 o la intensidad de la señal en un western blot20. Sin embargo, una desventaja significativa de estos enfoques es que el ensayo es muy laborioso y propenso a un alto ruido en los resultados, ya que cada punto de temperatura individual debe recopilarse de forma independiente.

Finalmente, se pueden utilizar varias técnicas biofísicas más avanzadas para evaluar la calidad de la proteína de membrana de manera similar a FSEC, por ejemplo, análisis de dispersión inducida por flujo21, termoforesis a microescala22 o SPR. Aunque son enfoques muy poderosos, la desventaja de estos métodos es la necesidad de instrumentos altamente especializados para ejecutar los análisis.

En conclusión, FSEC proporciona una herramienta invaluable para su uso en campañas de producción de proteínas de membrana, y aunque no es la única opción, tiene varias ventajas distintas sobre otros métodos, como se mencionó anteriormente. Siempre se recomienda la validación cruzada de los resultados mediante ensayos ortogonales, y ninguno de los métodos discutidos anteriormente son mutuamente excluyentes entre sí.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer la ayuda y el apoyo de todo el equipo de Peak Proteins. Desde el equipo de ciencia celular, nos gustaría reconocer a Ian Hampton por sus valiosos conocimientos y orientación en la expresión de células de insectos. Nos gustaría agradecer a Mark Abbott por proporcionar los recursos y la oportunidad para llevar a cabo este proyecto.

Materials

1 mL and 5 mL plastic syringes  Generic  -  Syringes for transfer of samples 
10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail Abcam ab201111 Protease inhibitors
15 mL tubes   Generic  -  15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation  
2 mL ultra-centrifuge tubes Beckman Coulter  344625  Tubes for ultra-centrifuge rotor 
50 mL tubes Generic  -  50 mL tubes for cell harvest 
96 deep-well blocks  Greiner 15922302 For collecting 0.2 mL SEC fractions 
ÄKTA  V9-L loop valve Cytiva  29011358 5 posiiton loop valve  for the ÄKTA FPLC system
ÄKTA F9-C fraction collector Cytiva  29027743 6 position plate fraction collector for the ÄKTA FPLC system
ÄKTA pure 25 L Cytiva  29018224  FPLC system for running the experiment 
Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L)   Fisher Scientific  15828722  Centrifuge for low-speed spin 
Blunt end filling needles  Generic  -  For transfer of samples 
Bottle top vacuum filter  Corning 10005490 Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers
Cholesteryl hemisuccinate (CHS)  Generon  CH210-5GM  Additive for detergent solubilisation  
Disposable multichannel reseviour  Generic  -  Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate
Dodecyl maltoside (DDM)  Glycon  D97002-C-25g  Detergent for solubilisation 
eGFP protein standards BioVision K815-100 eGFP standards for fluorescent calibration curve 
Glycerol Thermo Scientific  11443297 Glycerol for buffer preparation
HEPES Thermo Scientific  10411451 HEPES for buffer preparation
High molecular weight SEC calibration standards kit Cytiva  28403842 Molecular weight calibration kit for SEC
Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG)  Generon  NB-19-0055-5G  Detergent for solubilisation 
Low molecular  weight SEC calibration standards kit Cytiva  28403841 Molecular weight calibration kit for SEC
MLA-130 ultra-centrifuge rotor Beckman Coulter  367114  Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes
Opaque 96-well flat-bottom micro-plate  Corning 10656853 96-well for reading fluorescent signal in plate reader 
Optima MAX-XP ultra-centrifuge Beckman Coulter  393315  Centrifuge for high-speed spin 
pH meter Generic  -  For adjusting the pH of buffers during preparation
Prism GraphPad -  Graphing software for plotting traces
Rotary mixer  Fisher Scientific  12027144  Mixer for end over end mixing in the cold 
Sodium chloride Fisher Scientific  10316943 Sodium chloride for buffer preparation
Sodium hydroxide Fisher Scientific  10488790 Sodium hydroxide for buffer preparation
Spectramax ID3 Plate Reader Molecular Devices 735-0391 Micro-plate reader capable of reading fluorescence
Stirrer plate Generic  -  For stirring buffers during preparation
Styrene maleic acid (SMA)  Orbiscope  SMALP 300  Polymer for detergent free extraction 
Superdex 200 Increase 10/300 GL  Cytiva  28990944  SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 °C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa.
Vacuum pump Sartorius 16694-2-50-06 For filtering and degassing buffers
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Referenzen

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Rejnowicz, E., Wright, J., Veldman-Jones, M., Harborne, S. Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography. J. Vis. Exp. (191), e64322, doi:10.3791/64322 (2023).
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