蛍光サイズ排除クロマトグラフィーによる膜タンパク質品質の迅速評価(英語)

1. FSEC用の洗剤およびバッファー調製 洗剤原液を調製します。20 mLのストック溶液を調製するには、4 gのドデシルマルトシド(DDM)粉末と0.4 gのコレステリルヘミコハク酸(CHS)粉末を量り、実験室グレードの蒸留H2Oで20 mLにします。 すべての成分を添加した後、成分が完全に可溶になるまで4°Cでエンドオーバーエンド反転で混合します。4°Cで一晩のエンドオーバーエンド混合をお勧めします。 洗剤ストックを分注し、使用するまで-20°Cで保管します。ストックをすぐに使用する必要がある場合は、洗剤ストックを氷の上に保管してください。注意: この作業で使用された標準的な洗剤ストックは、20%(w / v)DDMと2%(w / v)CHS混合物でした( 材料の表を参照)。異なる洗剤を使用することができる(例えば、ラウリルマルトースネオペンチルグリコール;LMNG)、またはスチレン – マレイン酸(SMA)などのポリマーによる洗剤フリー抽出の使用を試験することができる。これは、テストする実験条件を設計するときに決定する必要があります。 可溶化バッファーを調製します。ビーカーで100 mM HEPES、200 mM NaCl、20 %(v/v)グリセロール、および1xプロテアーゼ阻害剤カクテル( 材料の表を参照)を達成するために、成分の正しい重量または容量を組み合わせて可溶化バッファーを調製します。注:本研究では、50 mLの可溶化バッファーの調製で5つのサンプルを処理するのに十分でした。 実験室グレードの蒸留H2Oの0.7容量(例えば、50mLのバッファーを作る場合は35mL)をビーカーに加える。 マグネチックスターラーで混合し、pHメーターを用いて、濃NaOHを滴下することにより緩衝液pHを7.5に調整する。 測定シリンダーを使用して、実験室グレードの蒸留H2Oでバッファーを最終的に必要な量まで補充します。 SEC 実行バッファを準備します。ビーカー中の最終濃度100 mM HEPES、150 mM NaCl、および10%(v/v)グリセロールを達成するために、成分の正しい重量または体積を組み合わせてSECランニングバッファーを準備します。注:本研究では、600 mLのSECバッファーを調製するだけで、5つのサンプルを実行するのに十分でした。 実験室グレードの蒸留H2Oの0.7容量(たとえば、600 mLのバッファーを作成する場合は420 mL)をビーカーに追加します。 マグネチックスターラーで混合し、pHメーターを用いて、濃NaOHを滴下することにより緩衝液pHを7.5に調整する。 測定シリンダーを使用して、実験室グレードの蒸留H2Oでバッファーを最終的に必要な量まで補充します。 SECバッファーをボトルトップの0.45 μmポアフィルターで真空下でろ過します(材料表を参照)。 バッファーがフィルターを通過したら、振とうしたときに気泡が現れなくなるまで真空下に置いて脱気します。 ステップ1で調製した洗剤ストックの必要量(例えば、600 mLのSECバッファーを作成する場合は0.9 mL)を加えて、最終濃度0.03%(w / v)DDMおよび0.003%(w / v)CHSをSECバッファーに追加します。 使用前にバッファーを事前に冷やしてください。注: テストする条件に応じて、異なるバッファーを使用できます。例えば、目的のタンパク質に対する異なる界面活性剤の効果をテストする場合、タンパク質の可溶化に使用したのと同じ界面活性剤を含むバッファーを作るのが理想的です。SMAで洗剤を含まない条件をテストする場合は、洗剤をSECバッファーから完全に省略する必要があります。ただし、洗剤スクリーニングのプロトコル変更の詳細については、説明セクションを参照してください。 2. FSECのためのサンプル調製 セルペレットを準備します。注:アッセイの開始点は、目的のGFPタグ付き(または他の蛍光標識)タンパク質の浮遊細胞発現培養物から細胞ペレットを採取することです。採取の正確なタイミングと条件は、発現されるタンパク質、使用される細胞株、増殖した細胞の条件、およびタンパク質発現が誘導された方法によって異なります。これらの詳細は、このプロトコルの範囲を超えています。この研究では、試験する条件ごとに0.5〜1 gのSf21細胞ペレットを使用し、P2バキュロウイルスの1:20希釈の約4 x 106 生細胞/ mLの感染後25〜50 mLの培養液に相当します。ここに記載されているプロトコルはテスト済みであり、他の真核細胞株(HEK293Eなど)からの細胞ペレットの同様の湿重量でも同様にうまく機能することがわかっていることに注意してください。浮遊培養液からの細胞を回収する準備ができたら、25〜50 mLの培養アリコートを50 mLのコニカルチューブに移します。 チューブをカウンターバランスし、スイングアウトバケット( 材料表を参照)でベンチトップ遠心分離機を2,000 x g で室温で15分間使用して、細胞をペレット化します。 培養上清を軽く傾けて取り出して廃棄するか、細胞ペレットが特に緩い場合は、ピペットフィラーを含む50 mLピペットを使用します。 細胞をすぐに分析に使用する場合は、細胞ペレットを氷上に置き、ステップ5に直接進みます。細胞を後の段階で使用するために保存する場合は、細胞を-80°Cに置いて凍結します。 細胞ペレットが-80°Cで保存されている場合は、室温で15分間、またはサンプルが凍結しなくなるまでインキュベートして急速に解凍します。この手順に従って、サンプルをすぐに氷に移動します。 サンプルを再懸濁して可溶化します。2 mLの可溶化バッファーを細胞ペレットに加えます(ステップ1.2)。 エンドオーバーエンド反転状態で4°Cで15〜30分間均質になるまでインキュベートします。 最終濃度が1M / 0.1%CHSになるまで、プレミックス洗剤ストック(ステップ1.1)(例:100 μLの20M / 2%CHSストック)を追加します。 4°Cでエンドオーバーエンド反転しながら30分間可溶化します。注:必要に応じて、複数の条件を並行してテストできます。一度に処理できる並列サンプルの数は、SEC実験を実行するために利用可能なシステムによって異なります。ここで説明するセットアップでは、一度に最大5つのサンプルを処理することができました。 低速遠心分離工程を行う。サンプルをプレチルド(4°C)ベンチトップ遠心分離機でスイングアウトバケットで2,000 x g で15分間遠心分離します。 高速遠心分離工程を行う。低速スピンによるペレットの乱れないように注意しながら、5mLシリンジに取り付けられた鈍端針を使用して、低速遠心分離から超遠心チューブ(0.5〜2 mLチューブなど)に上清を慎重に移します。 チューブのペアを0.05 g以内にバランスさせ、固定角度の超遠心分離ローターに入れます( 材料の表を参照)。 4°Cで250,000 x gで30分間遠心分離します。 3. サイズ排除クロマトグラフィー(SEC) 高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)システムを調製し、カラムを平衡化します。たとえば、システムにSECバッファーを充填し、ポンプから空気をパージすることにより、製造元の指示に従ってシステムを準備します( 材料表を参照)。 SECカラムをFPLCに接続し、カラムに空気が入らないようにします。これは、FPLCシステムの流路とのドロップツードロップ接続を実行するために、水で満たされたシリンジ(カラムの底部に取り付けられている)でSECカラムに背圧を加えることによって達成されます。 SECカラムを最初に実験室グレードの蒸留およびろ過されたH2Oの1.5カラム容量(24 mLカラムの場合は36 mL)で洗浄し、次にカラムに推奨される流量と圧力で1.5カラム容量のSECバッファーで洗浄することにより、SECカラムを事前平衡化します( 材料表を参照)。注:この研究でFSECを実行するために使用されたFPLCシステムは、寒い環境にあり、5ポジションループバルブと6ポジションプレートフラクションコレクターが取り付けられていました。この設定により、5つのサンプルをロードし、実行間に手動で介入することなく、同じカラムに自動で順番に実行できます。SEC実験を実行するために、10〜600 kDaの分子量範囲のタンパク質を分解できる樹脂を含む市販のプレパック24 mLカラムを使用しました( 材料の表を参照)。目的のタンパク質が特に大きい場合は、代わりに代替カラムマトリックスを使用して、分子量5,000 kDaまでのタンパク質を分離することができます。界面活性剤/脂質ミセルの存在は、使用するタンパク質と界面活性剤に応じて、膜タンパク質の全体的なサイズが>150 kDa増加することに注意してください。 サンプルを列に適用し、SEC 実験を実行します。シリンジに取り付けられた鈍端針を使用して、高速遠心分離ステップから1 mLシリンジに上清を移します。これにより、ペレットを乱すことなく遠心分離管からサンプルを回収することができます。 サンプルループをロードするように設定します。シリンジから600〜700 μLのサンプルをローディングポートに注入することにより、500 μLのサンプルループをオーバーフィルします。使用するシステムに応じて、このロードステップをメソッドにプログラムして、間違いがないことを保証することができます。 メソッドの際、カラムの推奨流量と圧力で4 mLのSECバッファーでサンプルを空にして、ループからカラムに注入します( 材料の表を参照)。 バッファーの 1.5 カラム容量 (24 mL カラムの場合は 36 mL) が通過するまで、同じ流速でカラムを実行します。 カラム容量の0.25(24 mLカラムの場合は6 mL)で、90フラクションを収集するために0.2 mLフラクションの収集を開始します。注:カラムのボイド容量は0.3カラム容量と予想されるため、この直前にフラクションの収集を開始すると、ボイドボリュームに存在するタンパク質を含むすべてのタンパク質の溶出が確実に監視されます。 4. 蛍光トレースの収集と分析 サンプルをフラクションコレクターから96ウェルプレートに移し(ステップ3.2.5)、蛍光シグナルを読み取ります。蛍光測定値を取得する前に、収集したサンプルを希釈してください。マルチチャンネルピペットを使用して、90 μLの実験室グレードの蒸留H2Oをリザーバーから不透明な平底96ウェルプレートの各ウェルに移します( 材料表を参照)。 ステップ3.2.5でフラクションを96ウェルブロックに回収した場合は、マルチチャンネルピペットを使用して、10 μLのSECフラクションをブロックから不透明な平底96ウェルプレートに移し、上下にピペッティングして混合します。それ以外の場合、ステップ3.2.5中にSECフラクションを個々のチューブに収集した場合は、各フラクションの10 μLを不透明な平底96ウェルプレートに1つずつ移し、毎回上下にピペッティングしてサンプルを混合します。 不透明な平底96穴プレートをプレートリーダーに入れ、蛍光を測定する。GFPが蛍光標識体(ここで使用する場合)の場合は、励起をできるだけ488 nmに近づけ、507 nmにできるだけ近い蛍光発光を検出します。注:蛍光読み取りを行う前に必要な希釈は、発現培養物に存在する目的タンパク質の総量と、使用するプレートリーダーの感度によって異なります。この研究で示された例では、サンプルを水で10倍希釈しました。出発点の提案として、画分は検出前に水またはバッファーで5〜10倍希釈する必要があります。記録されたFSECトレースシグナルが特に低い場合は、代わりに、より小さな希釈液または希釈されていないサンプルを使用できます。この研究で検出に使用したデバイスは、488 nmで励起し、507 nmで蛍光発光を検出できるプレートリーダーでした( 材料の表を参照)。 FSEC トレースをプロットします。プレートリーダーからデータを生の形式(生のテキストまたはカンマ区切り値ファイル)でエクスポートします。これらの生データは、FSECトレースのY軸にプロットされます。 X軸については、各フラクションが収集された体積を計算します。最初のウェルは、分画遅延を考慮するために最初のフラクションが収集された溶出量である必要があります(この例では6 mL)。この後のフラクションは、収集されたフラクション容量(この例では0.2 mL)だけ順次増加する必要があります。 X軸とY軸のデータが計算されたら、データをコピーしてグラフ作成ソフトウェア( 材料表を参照)に貼り付け、各ウェルの蛍光シグナルをカラムから溶出した体積に対してプロットします。注: 図 1 は、FSEC 実験を実行するために必要な手順の概略 図 を示しています。 FSEC トレースを分析します。空隙量(24 mLカラムで約8 mL)でのタンパク質溶出量を評価します。これは、タンパク質のサイズが非常に大きく、折りたたまれていない/凝集している可能性が高いことを示しています。 折り畳まれたタンパク質を示す後続のピークで溶出するタンパク質の量を評価します。これは、タンパク質サイズに応じて、24 mLカラムで10 mL〜16 mLになると予想されます(界面活性剤/脂質ミセルに関連する場合)。ピーク形状、特に3〜4 mLを超えるブロードまたはスプリットピーク(24 mLカラムの場合)は、多分散サンプルを示すため、ピーク形状に細心の注意を払ってください。 モノマーピークに記録された最大信号をボイドピークの最大信号で割ることにより、モノマーピーク高さとボイドピーク高さとの比を算出する。注:この値は単分散度指数を表し、タンパク質の品質を定量的に測定できます。値が大きいほど可能な限り最高の品質を示し、1未満の値は折り畳まれたタンパク質よりも凝集したタンパク質が多いため、問題のあるサンプルを示します。 複数のFSECランを比較する場合、最も重要な特徴がそれぞれの場合のモノマーの量である場合、プレートリーダー(RFUなど)によって記録された生信号としてトレースをプロットします。注:アンフォールディングタンパク質と比較したモノマー量の比較がより重要な場合は、トレースの最小測定値と最大測定値を使用してシグナルを全シグナルのパーセンテージに正規化する必要があり、トレース間の凝集タンパク質とモノマータンパク質の比率の違いが強調されます。 図1:FSEC実験を実行するために必要なステップの概略図。 (1)目的の蛍光タグ付きタンパク質を発現する細胞を可溶化する。(2)粗可溶化は、最初に低速スピンで清澄化し、次に(3)高速スピンで清澄化する。(4)清澄化されたサンプル上清をロードして適切なSECカラムに流し、(5)フラクションを収集します。(6)フラクションのサンプルを96ウェルプレートに移し、プレートリーダーを使用してGFP蛍光シグナルを検出して、(7)FSECトレースをプロットします。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。