선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가

선천성 면역 체계는 감염 중 및 조직 손상 및 항상성 변화와 같은 무균 자극에 대한 반응으로 첫 번째 방어선 역할을 합니다. 세포 표면과 세포질의 선천성 면역 센서는 병원체 또는 손상 관련 분자 패턴(각각 PAMP 또는 DAMP)에 반응하여 염증 신호 전달 경로 및 세포 반응을 유발합니다. 선천성 면역 반응의 핵심 과정 중 하나는 감염되거나 손상된 세포를 제거하고 추가 선천성 및 적응성 면역 반응을 유도하기 위한 세포 사멸을 유도하는 것입니다. 프로그램된 세포 사멸(PCD)은 종 전반에 걸쳐 고도로 보존된 과정으로, 타고난 면역 메커니즘으로서의 진화적 중요성을 강조합니다.

모든 세포 유형에서 활성화될 수 있는 몇 가지 선천성 면역 PCD 경로가 있습니다. 카스파제는 고도로 보존된 세포내 시스테인 의존성 프로테아제의 핵심 계열로, 전통적으로 비염증성 세포자멸사 경로뿐만 아니라 파이롭토시스, 괴사증 및 PANoptosis와 같은 염증성 PCD 경로를 포함한 많은 PCD 경로에서 중요합니다 1,2,3,4,5 . 잘 정의 된 11 개의 인간 카스파제와 10 개의 뮤린 카스파제뿐만 아니라 기능적 일 수있는 유사 카스파제가 있으며, 대부분은 활성화를 위해 절단을 필요로하는 비활성 단량체 또는 이량체 프로 카스파제로 구성 적으로 표현됩니다 ^6,7. 카스파제는 또한 다단백질 복합체의 모집 및 형성을 위한 중요한 영역을 포함합니다. 여기에는 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-4, 카스파제-5, 카스파제-9 및 카스파제-11에서 찾을 수 있는 카스파아제 활성화 및 모집 도메인(CARD) 또는 카스파제-8 및 카스파제-10에서 발견되는 사멸 이펙터 도메인(DED)이 포함됩니다. 단백질 분해 활성과 다단백질 복합체 형성 능력을 통해 카스파제는 선천성 면역 PCD의 중요한 동인입니다.

선천성 면역 PCD에서 카스파제의 역할은 세포자멸사에서 처음 확인되었으며, 개시제 카스파제, 카스파제-2, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-10이 사형집행자 카스파제, 카스파제-3, 카스파제-6 및 카스파제-7을 활성화시켜 세포 사멸을 유도합니다 8,9,10,11,12. 개시제 카스파제는 다양한 신호 캐스케이드에 의해 활성화될 수 있습니다. 외인성 경로는 세포외 리간드 유도 사멸 수용체 신호전달을 통해 카스파제-8을 활성화시키고, 내인성 경로는 미토콘드리아 완전성의 파괴를 통해 카스파제-9를 활성화한다¹³. 활성화된 개시제 카스파제는 링커를 절단하여 사형집행인 카스파제의 크고 작은 촉매 서브유닛을 분리하여 활성 형태를 생성합니다. 그런 다음 사형 집행인 카스파제는 기질을 쪼개어 세포를 분해하여 DNA 분해, 막 블레빙, 핵 단편화 및 세포자멸사 방출을 초래합니다^14,15. 이 과정은 전형적으로 비용해성 및 비염증성 형태의 세포 사멸로 끝나며, 이는 efferocytosis에 의한 죽어가는 세포의 즉각적인 제거와 결합될 때 이루어진다¹⁶. 그러나, efferocytosis의 결함 또는 식세포의 부족은 세포 사멸 세포의 축적으로 이어질 수 있으며, 이는 용해 및 염증 세포 사멸을 겪는다^17,18.

카스파제-1(인간 및 마우스), 카스파제-4 및 카스파제-5(인간), 카스파제-11(마우스)을 포함한 염증성 카스파제는 파이롭토시스라고 하는 염증성 선천성 면역 PCD(III-PCD)의 한 형태 동안 활성화되는 것으로 밝혀졌습니다. 카스파제-1 활성화는 세포질 선천성 면역 센서, 어댑터 분자(CARD[ASC]를 포함하는 세포자멸사 관련 반점 유사 단백질) 및 카스파제-1을 포함하는 다단백질 복합체인 인플라마솜의 형성과 관련이 있습니다. 이 복합체의 형성은 카스파제-1이 근접 매개 자가단백질 분해를 거쳐 활성 형태를 방출할 수 있도록 하며, 이는 전염증성 사이토카인인 인터루킨(IL)-1β 및 IL-18과 기공 형성 분자 gasdermin D(GSDMD)19,20,21,22,23를 포함한 표적 기질을 절단할 수 있습니다 . 카스파제-11, 카스파제-4 및 카스파제-5는 또한 지질다당류(LPS)^19,20와 같은 PAMP를 감지한 후 인플라마솜의 상류 형성 없이 GSDMD를 활성화할 수 있습니다. 이들 카스파제는 이량체화에 이어 세포질 LPS에 결합할 때 활성화를 위한 올리고머화 및 자가절단을 거치며, 이는 IL-1β 및 IL-18 성숙을 유도하기 위해 세포 내재적 방식으로 비정준 인플라마좀 활성화 24,25,26 및 카스파제-1 활성화를 유도한다 ²⁰. 이러한 전염증성 사이토카인의 성숙과 방출은 이러한 카스파제를 “염증성”으로 특징짓습니다. 또한, 아폽토시스 카스파제-8은 인플라마솜에 국한되어 아폽토시스와 파이롭토시스 과정 사이의 연관성을 제공하는 것으로 밝혀졌습니다. 연구에 따르면 아폽토시스 카스파제-8은 괴사라고 하는 또 다른 형태의 PCD를 조절하는 데에도 중요합니다. 카스파제-8의 손실은 자발적인 수용체 상호작용 세린-트레오닌 키나아제 3(RIPK3) 매개 혼합 계통 키나아제 도메인 유사 슈도키나아제(MLKL) 활성화를 초래하여 괴사 27,28,29,30,31,32,33,34,35의 III-PCD 경로를 구동합니다.

카스파제는 역사적으로 카스파제에서 발생하는 세포 사멸 유형에 따라 “세포사멸” 또는 “염증성”으로 분류되어 왔지만, 카스파제를 통한 선천성 면역 PCD 경로 사이에 광범위한 혼선이 있음을 시사하는 증거가 늘어나고 있습니다 ^3,4. 예를 들어, inflammasomes의 염증성 카스파제-1은 표준 활성화 부위³⁴에서 세포사멸 카스파제-7을 절단합니다. 카스파제-1 활성화는 또한 폴리(ADP-리보스) 중합효소 1 (PARP1)³⁶과 같은 아폽토시스 기질의 절단을 유도할 수 있다. GSDMD가 결핍된 세포에서 카스파제-1은 또한 카스파제-3^37,38을 절단할 수 있습니다. 추가적으로, 정준적으로 아폽토시스 카스파제-3은 가스더민 E(GSDME)를 절단하여 PCD^17,18을 유도할 수 있고^, 또한 GSDMD를 비활성 형태⁴⁰으로 처리할 수 있다. 또한, 인플라마좀 복합체에 대한 카스파제-8 모집은 39,40,41,42,43,44,45로 관찰되었으며^, 카스파제-8은 정준 및 비정준 인플라마좀 활성화의 핵심 조절자이다 ³⁹. 또한 많은 염증 조건에서 카스파제-8 및 카스파제-1에 대한 중복되고 중복된 역할이 존재하며, 발열, 세포사멸 및 괴사 성분의 활성화를 특징으로 하는 선천성 면역 PCD는 질병 스펙트럼 39,46,47,48,49,50에 걸쳐 발생합니다.

염증성 카스파제와 세포자멸사 카스파제 사이의 이러한 혼선을 기반으로 선천성 면역과 PCD에 대한 기계론적 이해의 주요 격차가 확인되어 PANoptosis의 발견으로 이어졌습니다. PANoptosis는 병원체, PAMP, DAMP 및 항상성의 변화에 반응하여 활성화되는 독특한 형태의 III-PCD이며 다른 세포 사멸 경로의 구성 요소를 통합하는 다면적 거대분자 복합체인 PANoptosomes에 의해 조절됩니다 44,50,51,52,53,54,55 . PANoptosis는 카스파제-1, 카스파제-11, 카스파제-8, 카스파제-9, 카스파제-3 및/또는 카스파제-7을 포함한 다중 카스파제의 활성화를 특징으로 하기 때문에 PANoptosis에서 생물학적 효과의 총체는 pyroptosis, apoptosis^또는 necroptosis 단독으로 개별적으로 설명될 수 없습니다 3,4,35,36,39,46,47,48^, 문맥에 따라 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptosis는 감염성 및 염증성 질환뿐만 아니라 암 및 암 치료법에 점점 더 연루되어 왔습니다 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,^54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

세포자멸사, 파이롭토시스, 괴사증 및 PANoptosis를 포함한 세포 사멸 경로 전반에 걸쳐 카스파제의 필수적인 역할을 감안할 때, 카스파제의 활성화를 특성화하고 PCD 경로의 전체 복잡성을 이해하는 기술을 개발하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 세포를 자극하고 카스파제의 후속 활성화를 측정하는 방법을 자세히 설명합니다(그림 1). 이 방법은 일반적으로 활성화에 필요한 카스파제의 단백질 분해 절단을 연구 수단으로 활용합니다. 웨스턴 블로팅을 통해 단백질 크기를 측정할 수 있으며, 이를 통해 비활성 프로카스파제와 활성화된 절단 형태를 명확하게 시각화하고 구별할 수 있습니다.

이 프로토콜의 주요 이점은 1) PCD 활성화를 보다 정확하게 결정하기 위해 내인성 세포의 단일 집단에서 병렬로 여러 카스파제의 활성화를 평가하는 능력과 2) 광범위한 교육이나 값비싼 장비가 필요하지 않은 비교적 간단한 실험실 기술의 사용입니다. 이전 프로토콜은 배양 상층액, 세포 및 조직 용해물, 현미경을 통한 전체 세포 및 생체 내 67,68,69,70,71에서 카스파아제 활성화를 모니터링하기 위해 웨스턴 블로팅^, 형광 리포터 또는 항체 염색을 사용했지만 이러한 기술은 일반적으로 샘플에서 하나 또는 두 개의 카스파제만 모니터링합니다. 또한, 절단 시 형광을 발하는 카스파제 절단 부위를 함유하는 합성 펩타이드 기질이 세포 또는 조직 용해물에서 카스파제 활성화를 모니터링하기 위해 사용되어 왔지만(⁶⁹), 이들 기질은 종종 하나 이상의 카스파제에 의해 절단될 수 있어, 이 시스템에서 개별 카스파제의 특이적 활성화를 결정하기 어렵게 만든다. 또한 형광 리포터 또는 기타 태그 기반 방법을 사용하는 대신 웨스턴 블로팅을 사용하면 연구자가 리포터 유전자로 특정 세포주를 만드는 대신 내인성 세포를 사용할 수 있습니다. 내인성 세포를 사용하는 데에는 많은 불멸화 된 세포주가 주요 세포 사멸 분자^72,73이 결핍되어 결과에 영향을 미칠 수 있다는 사실을 포함하여 여러 가지 이점이 있습니다. 또한 내인성 세포를 사용하면 단일 계통이 아닌 대식세포, 상피 세포 및 내피 세포와 같은 다양한 세포 유형을 평가할 수 있습니다. 웨스턴 블로팅은 또한 크고 값비싼 장비나 복잡한 설정 없이 전 세계 실험실에서 수행할 수 있는 비교적 간단하고 비용 효율적인 기술입니다.

이 프로토콜은 다른 염증 신호 전달 경로에서의 스캐폴딩 역할 및 기능을 포함하여 카스파제의 세포 사멸 의존성 및 세포 사멸 비의존적 기능을 모두 이해하기 위해 생물학 전반에 걸쳐 광범위하게 적용할 수 있습니다⁷⁴. 이 방법을 적용하면 질병 및 상태 전반에 걸친 선천성 면역 PCD 경로 및 염증 신호 연구에서 통합된 접근 방식이 가능하며, 이 프로토콜은 미래 치료 전략의 개발을 알릴 중요한 조절 과정과 기계론적 연결을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.