インビトロ ナノエマルジョンワクチンアジュバントオフィオポゴニンDの細胞活性評価
Summary
このプロトコルは、ナノエマルジョンオフィオポゴニンDアジュバントが効果的な細胞性免疫応答を促進するかどうかを評価するための詳細な方法を提示する。
Abstract
ワクチンの主成分として、アジュバントは、抗原に関連する強力で広範囲にわたる自然免疫応答および適応免疫応答を直接誘導または増強することができます。オフィオポゴン・ジャポニクスの植物から抽出した精製成分であるオフィオ ポゴニンD(OP-D)は、ワクチンアジュバントとして有用であることが分かっている。OP−Dの低い溶解性および毒性の問題は、ナノエマルジョンオフィオポゴニンD(NOD)を調製するために低エネルギー乳化法を使用することによって効果的に克服することができる。本稿では、細胞活性評価のための一連の in vitro プロトコルについて検討する。 L929の細胞傷害効果を、細胞計数キット−8アッセイを用いて決定した。次いで、免疫マウスからの脾細胞の刺激および培養後の分泌サイトカインレベルおよび対応する免疫細胞数を、ELISAおよびELISpot法により検出した。さらに、C57BL/6マウスから単離し、GM-CSFとIL-4とのインキュベーション後に成熟させた骨髄由来樹状細胞(BMDC)における抗原取り込み能をレーザー走査型共焦点顕微鏡(CLSM)によって観察した。重要なことに、マクロファージの活性化は、ブランクマウスの腹膜マクロファージ(PM)をアジュバントと24時間共培養した後、ELISAキットによってIL-1β、IL-6、および腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)サイトカインのレベルを測定することによって確認されました。このプロトコルが、新しいワクチンアジュバントの細胞応答の有効性を評価するための直接的かつ効果的な実験的アプローチを他の研究者に提供することが期待されています。
Introduction
ワクチンは、感染症や非感染性疾患を予防・治療するための重要な手段です。ワクチン製剤へのアジュバントとデリバリービヒクルの適切な添加は、抗原の免疫原性を高め、長期的な免疫応答を生成するのに有益です1。現在市販されているワクチン用アジュバントには、従来のアジュバントミョウバン(アルミニウム塩)の他に、MF59 2,3、AS04 3、AS03 3、AS01 3、CpG10184、Matrix-M5の6種類があります。一般に、人体がウイルスの攻撃に遭遇すると、第1および第2の防御線(皮膚、粘膜、マクロファージ)が主導権を握ってウイルスを除去し、最後に免疫器官と免疫細胞を含む第3の防御線が活性化されます。アルミニウム塩とアルミニウム塩は、1920年代初頭からヒトワクチンに最も広く使用されているアジュバントであり、効果的な自然免疫応答を誘発しています6。しかし、免疫細胞を刺激してサイトカインとケモカインの特定のセットを生成する古典的なアジュバントによる抗原提示細胞(APC)の活性化は、アジュバントが機能するメカニズムであり、アジュバントが特定の免疫応答に一時的な影響のみを及ぼす理由の1つである可能性が提案されています7。ヒトが使用するための限られた認可されたアジュバントの存在は、効果的な免疫応答を誘発するワクチンを開発するための制限要因です8。
現在、ますます多くのアジュバント研究が、マウスにおいて強力な細胞性免疫応答を誘導する能力を実証している。QS-21は、バランスの取れたTヘルパー1(Th1)およびTヘルパー2(Th2)免疫応答を誘導し、より高いレベルの抗体力価を生成し、アジュバントとしての保護を延長することが示されていますが、その強力な毒性と溶血特性は、スタンドアロンの臨床アジュバントとしての開発を制限します9,10。OP-D(ルスコゲニン-O-α-L-ラムノピラノシー1-(1→2)-β-D-キシロピラノシル-(1→3)-β-D-フコピラノシド)は、中国の薬用植物オフィオポゴンジャポニカス4の根から単離されたステロイドサポニンの1つです。さらに、それは基数オフィオポゴニスに見られる主要な薬理学的に活性な成分(シェンマイサン)であり、特定の薬理学的特性を持っていることが知られています11。さらに、ユリ科のメンバーであり、細胞の炎症や心筋損傷における抑制および保護効果のために広く使用されています。例えば、OP-Dは、BALB/cマウスにおいてDNCB誘発性アトピー性皮膚炎様病変および腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)炎症性HaCaT細胞を改善する12。重要なことに、OP-Dは、活性酸素種の生成とミトコンドリア膜損傷の両方を減らすことにより、心臓血管系の抗酸化保護を促進し、ドキソルビシン誘発性オートファジー損傷から心臓を保護します。実験によると、モノデスモシドと一緒にOP-Dを服用すると、免疫の健康を高め、白血球数とDNA合成を増やし、抗体を長持ちさせるのに役立ちます13。OP−Dがアジュバント効果を有することが以前に見出された14。
ナノエマルジョンは、界面活性剤、油、共界面活性剤、および水の組み合わせからなる水中油型ナノ製剤である12,15。これらのナノワクチン設計により、抗原とアジュバントを一緒にカプセル化して、免疫刺激を強化し、抗原を保護し、樹状細胞(DC)の成熟を促進することができます16。スクリーニングから得られるこれらの新規アジュバントの開発には、それらの細胞応答能力を評価するための適切な方法を見つけることが重要です。
このプロトコルの目的は、アジュバントが in vitro 細胞培養における食作用と免疫細胞の発現を増強できるかどうかを体系的に評価し、主な実験方法を詳しく説明することです。実験は4つのサブセクションに分かれています:(1)L929細胞に対するOP-DおよびNODの毒性は、細胞計数キット-8(CCK-8)アッセイによって決定されます。(2)免疫マウスにおける内分泌IFN-γおよびIL-17Aのサイトカインレベルおよび対応する細胞数を脾細胞刺激およびELISpotアッセイによって検出する;(3)アジュバント刺激後のDCの抗原提示能力を共焦点顕微鏡を用いて観察する;(4)アジュバントと共培養したノーマルマウスの腹膜マクロファージ(PM)から得られた上清中にIL-1β、IL-6、TNF-αの3種類のサイトカインが検出される。
Protocol
Representative Results
Discussion
サブユニットワクチンは優れた安全性を提供しますが、免疫原性は低くなります。免疫原性を高めるための主な戦略は、抗原を物理的に吸着またはアジュバントと結合させ、それらを薬物送達システムに組み込んで、DCによる取り込みと提示を促進することです。 キライアサポニンとその誘導体などの天然植物サポニンは非常に毒性が高く、ヒトワクチンの開発には適していません<sup class="x…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、中国国家重点研究開発プログラムの助成金番号2021YFC2302603、中国国家自然科学基金会プログラムの助成金番号31670938、32070924、82041045、および32000651、助成金番号2014jcyjA0107および重慶の自然科学財団プロジェクトプログラムの助成金番号2019jcyjA-msxmx0159、重慶大学院研究イノベーションプロジェクトの助成金番号CYS21519、 陸軍医科大学特別プロジェクトの助成金番号2020XBK24、および大学生向けの国家イノベーションおよび起業家精神プログラムの助成金番号202090031021。
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
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