小鼠胸腺细胞在δ样4表达基质细胞上的共培养和转导以研究T细胞白血病的癌基因

所有描述的动物实验均已获得NIH机构生物安全委员会（IBC）和动物护理和使用委员会（ACUC）的批准。有关与本协议中使用的所有试剂和材料相关的详细信息，请参阅 材料表 。有关逆转录病毒生产者细胞培养和维护程序的更多详细信息，请参阅已发布的指南19。有关协议的概述，请参见 图 1 。 1. 开始培养OP9-DL4细胞（第1天） 通过握住小瓶并在37°C的水浴中轻轻摇动来快速解冻OP9-DL4细胞。 立即将细胞转移到含有 5 mL OP9 培养基（MEM-α 培养基、10% FBS、50 U/mL 青霉素/链霉素、55 μM 2-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺）的离心管中以除去冷冻保护剂。 在室温下以300× g 离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于1mL OP9培养基中。 将 5 mL OP9 培养基放入 T25 烧瓶中，并将重悬的细胞加入该烧瓶中。在37°C和5%CO2下培养。 2-3天后，使用1：3分裂传代细胞（每周一，周三和周五传代细胞）。注意：在OP9-DL4细胞达到汇合之前将其分开。OP9-DL4烧瓶在第6-7天和第8-9+天必须达到80%–90%的汇合度，以便与胸腺细胞共培养。因此，重要的是要计划在分裂OP9-DL4细胞时需要多少OP9-DL4细胞。从烧瓶中弃去培养基，并用1x PBS洗涤单层。弃去PBS，加入1mL的0.25%胰蛋白酶，并在37°C下孵育1-5分钟，或直到细胞从烧瓶中脱落。重击烧瓶以去除细胞。注意：（可选）可以通过显微镜检查细胞解离的进展。 加入 5 mL OP9 培养基以灭活胰蛋白酶，并在重悬期间通过冲洗烧瓶的细胞覆盖表面来重悬细胞。 在室温下以 300 × g 离心细胞悬液 5 分钟，然后重悬于 3 mL 的 OP9 培养基中（用于 1：3 分裂）。 将 1 mL 细胞悬液放入已经含有 5 mL 新鲜 OP9 培养基的 T25 烧瓶中。冷冻/丢弃剩余的细胞。为了冷冻OP9-DL4细胞，将细胞重悬于90S / 10%DMSO中，比例为1mL冷冻培养基与一瓶细胞。 根据未来的要求，在 −80 °C 或液氮下冷冻在 1 mL 冷冻管中。储存在液氮中以延长储存时间。 2. 开始逆转录病毒产生细胞系的培养（第 1 天） 通过保持小瓶并在37°C的水浴中轻轻摇动来快速解冻逆转录病毒产生细胞系。 立即将细胞转移到含有 5 mL 逆转录病毒产生细胞培养基（RPC：DMEM，10% FBS）的离心管中以除去冷冻保护剂。 在室温下以300× g 离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于1mL RPC培养基中。 将 5 mL RPC 培养基放入 T25 烧瓶中，并将重悬的细胞加入该烧瓶中。在37°C和5%CO2下培养。 每 2-3 天以 1：5 至 1：8 的比例传代细胞。重击烧瓶以移开细胞，并通过用力移液重悬细胞。注意：这些细胞可以通过无胰蛋白酶的强力移液从烧瓶表面去除。或者，胰蛋白酶消化（0.05%胰蛋白酶/ 0.53mM EDTA），直到细胞易于分离并可以很容易地移液成单细胞悬浮液。 将细胞悬液以 300 × g 离心 5 分钟，然后重悬于 5 mL RPC 培养基中（1：5 分裂）。 将 1 mL 细胞悬液放入已经含有 5 mL 新鲜 RPC 培养基的 T25 烧瓶中。冷冻/丢弃剩余的细胞。以与OP9-DL4细胞相同的方式冷冻逆转录病毒产生细胞（步骤1.4.4.1–1.4.4.2）。 3. 在 6 孔板中开始培养逆转录病毒产生细胞（第 4-5 天） 在转染前 18–24 小时以 70%–90% 汇合度接种逆转录病毒产生细胞，在 2 mL RPC 培养基中的 6 孔组织培养板的每个孔中，并在 37 °C 和 5% CO2 下孵育。注意：每 2-5 × 105 至 1 × 106 个胸腺细胞转染两个逆转录病毒产生细胞的孔。 4. 转染逆转录病毒产生细胞以产生含有目的基因的逆转录病毒（第 5-6 天） 转染前1小时用新鲜的RPC培养基替换培养基。 制备脂质转染混合物（对于 6 孔板的每个孔 – 根据需要放大）：在 250 μL 还原血清培养基中稀释 4 μgDNA（2 μg 辅助质粒 （pCL-Eco） 和 2 μg 转移质粒 （pMIG）。轻轻混合。 将 10 μL 转染试剂与步骤 4.2 中的 250 uL 还原血清培养基混合。在室温下孵育5分钟。 孵育5分钟后，将稀释的DNA与稀释的转染试剂（总体积= 500μL）合并。轻轻混合，并在室温下孵育20-25分钟。 将 500 μL DNA/转染试剂混合物轻轻加入含有逆转录病毒产生细胞的孔中，方法是以打圈的方式滴到细胞上。通过来回摇动板轻轻混合，并将板在37°C培养箱中孵育16-24小时。注意：亚汇合细胞（80%–90%）最适合转染，并可能产生最高的病毒滴度。由于逆转录病毒产生细胞很容易从烧瓶中脱落，因此在处理这些细胞时避免突然移动。 5. 改变逆转录病毒产生细胞培养基（第6-7天） 转染后约16小时用2mL新鲜RPC培养基替换旧培养基。继续在37°C孵育细胞20-24小时。 在荧光显微镜下评估转染效率（可选）。注意：在此协议中，GFP阳性细胞是感兴趣的细胞（见 图2）。此步骤取决于选择在该协议中使用的逆转录病毒载体（主链中是否存在报告基因）。 6. 胸腺细胞制备和 CD4+ 和 CD8+ 细胞的消耗（第 6-7 天） 从4-6周大的C57BL / 6小鼠中收获胸腺。有关胸腺收获的更多详细信息，请参阅Xing和Hogquist20。注意：小鼠通过吸入CO2 然后颈椎脱位实施安乐死。 通过将胸腺放入培养皿中的 5 mL PBS 中来制备胸腺细胞单细胞悬液。使用无菌载玻片，将胸腺放在载玻片的磨砂表面之间，然后将载玻片轻轻摩擦在一起，在两个载玻片之间滚动胸腺。冲洗载玻片以收集细胞，并丢弃残留的胸腺基质组织。注意：一个胸腺的估计产量为90×10 6-100×106细胞，CD4和CD8耗竭后将保留约1%的细胞。使用年轻小鼠的胸腺组织以获得更好的细胞产量，因为小鼠胸腺在出生后头几周的细胞迅速增加，在4-6周龄达到平台期，随后逐渐渐开线21。使用自动血细胞计数器或任何其他方法对细胞进行计数。 通过细胞过滤器移取5mL胸腺悬浮液，通过30μm或40μm过滤器过滤胸腺悬浮液。将细胞以300× g 离心10分钟。 除去上清液，并通过每管添加（取决于样品大小）1 mL缓冲液1分钟，用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。加入 5 mL 细胞耗竭缓冲液（500 mL PBS [pH 7.2]、0.5% BSA、2 mM 0.5M EDTA、pH 8.0）使 ACK 裂解缓冲液失活，以 300 × g 离心 10 分钟，然后重悬于 1–5 mL 细胞耗竭缓冲液中进行计数。注意：在耗尽（去除前）之前将以下内容放在冰上：70 μL 细胞悬液计数（根据所选的计数细胞方法而变化）和 200 μL 细胞悬液，通过染色 CD4 和 CD8 并通过流式细胞术分析来确定去除效率22，23。 计数细胞，并以300× g 离心10分钟。将细胞重悬于1 × 107/80 μL细胞去除缓冲液中。每 1 个× 107 个细胞中加入 CD4 和 CD8 微珠各 10 μL。充分混合，并在冰箱（2-8°C）中在黑暗中孵育15分钟。 用 2 mL 去除缓冲液冲洗并丢弃流出物来制备去除柱。 通过每 1 个 1 ×7 个细胞 加入 1–2 mL 去除缓冲液来洗涤步骤 6.6 中的细胞，并以 300 × g 离心 10 分钟。取出并弃去上清液。 在 500 μL 耗尽缓冲液中重悬至1.25 × 108 个细胞。将细胞悬液应用于色谱柱，并收集流出物（未标记的细胞）。用 1 mL 缓冲液洗涤色谱柱 2 倍，并收集流出物。注意：仅当色谱柱储液槽为空时才添加新缓冲液。去除后在冰上留出以下内容（耗尽后对照）：70 μL 细胞悬液计数（根据所选的计数细胞方法而变化）和 1，000 μL 细胞悬液，通过染色 CD4 和 CD8 并通过流式细胞术分析来确定去除效率22，23。 通过将去除前收集的 200 μL 细胞分成四个 FACS 管来染色去除效率对照：未染色、CD4 单染色、CD8 单染色和 CD4/CD8 双染色（使用未染色和单染色样品设置流式细胞术参数）。使用去除后收集的 1，000 μL 细胞对 CD4 和 CD8 进行染色，并与去除前收集的双染色样品进行比较（参见 图 3 中的典型去除结果）。注意：根据抗体制造商的建议调整流式细胞术染色体积（例如，50 μL 缓冲液中每 1 x 106 个细胞 1 μL 抗 CD4-FITC + 0.5 μL 抗 CD8-PE）。 7. 在OP9-DL4细胞上培养胸腺细胞（第6-7天） 将 2-5 × 105 至 1 × 106 个去除后胸腺细胞放入含有细胞因子（10 ng/mL 重组 IL-7 和重组 hFLT-3）的 OP9 培养基中的 80%–90% 汇合 OP9-DL4 细胞的 T25 烧瓶中。在37°C和5%CO2下培养。在OP9-DL4细胞上生长约24小时。注意：使T细胞可转导需要此持续时间（参见 图4中的典型结果）。保留一个胸腺细胞和OP9-DL4细胞共培养的T25烧瓶用作对照（未转导）。未转导的胸腺细胞将与转导的胸腺细胞一起染色（步骤9.1）作为阴性对照，以评估转导效率。未转导的胸腺细胞也可用于测量转基因表达对细胞分化的影响。1个月后丢弃含细胞因子的培养基。 8.从上清液中收获逆转录病毒并用它来转导胸腺细胞（第8-9天） 通过倾斜 6 孔板并将 3-5 mL 注射器定位在板底部，同时拉动柱塞吸出上清液，从转染的细胞中收集含有逆转录病毒的上清液。用 2 mL 新鲜 RPC 培养基替换培养基。继续将细胞在37°C孵育20-24小时，以便在步骤8.9中进行第二次转导。 通过0.45μm注射器过滤器过滤逆转录病毒上清液，并将滤液收集在50mL管中。注意：不要冷冻逆转录病毒上清液。使用新鲜制备的病毒制剂进行转导。 通过积极移液从OP9-DL4培养物中收集胸腺细胞，以从烧瓶表面去除胸腺细胞和OP9-DL4细胞。通过 40 μm 细胞过滤器过滤细胞悬液以去除大部分 OP9-DL4 细胞，并将滤液收集在 50 mL 管中。注意：OP9细胞非常粘附。虽然积极的移液可以从烧瓶中去除一些OP9-DL4细胞，但在此过程中OP9-DL4单层的破坏很小，并且由于OP9-DL4细胞比原代胸腺细胞大得多，因此脱落的OP9-DL4细胞将被40μm细胞过滤器过滤掉。如果OP9-DL4细胞仍为80%–90%汇合，则取出胸腺细胞，并将它们重新接种在同一OP9-DL4烧瓶中。或者，必须准备一个新的OP9-DL4烧瓶。 将步骤8.3中的滤液中的胸腺细胞以300× g 离心5分钟。弃去上清液。 在 50 mL 管中，将胸腺细胞重悬于 0.5–1 mL OP9 培养基 + 细胞因子中（参见步骤 7.1）。加入 1–2 mL 含有病毒的 RPC 培养基（RPC 培养基是胸腺细胞培养基的两倍）。加入六氯乙烯溴化物（10 μg/μL 储备液浓度），产生 8 μg 六氯乙烯溴化物/mL 总细胞悬液。 通过在室温下以850× g 离心细胞1小时来旋转。 将细胞重悬于每个烧瓶的6mL OP9培养基+细胞因子中（参见步骤7.1），并将悬浮液加回OP9-DL4细胞单层。注意：或者，准备新的OP9-DL4烧瓶以接收转导的胸腺细胞。如果要将胸腺细胞放回用过的OP9-DL4烧瓶中，请确保在胸腺细胞棘细胞形成1小时内向OP9-DL4细胞中添加新鲜的OP9培养基，以保持细胞健康并确保80%-90%的汇合度。 在37°C孵育过夜。 使用含有逆转录病毒的细胞上清液的新孔重复步骤8.2–8.7。 9.在OP9-DL4培养物上维持转导的胸腺细胞2-5天或根据需要冷冻（第9+天） 通过流式细胞术评估胸腺细胞分化，方法是对胸腺细胞进行 T 细胞发育标志物（如 CD4、CD8、CD25 和 CD4423）染色。参见 图5中典型的胸腺细胞分化结果。