Utilisation de l’imagerie in vivo pour dépister les phénotypes de morphogenèse chez les souches mutantes de Candida albicans au cours d’une infection active chez un mammifère hôte

Les études de ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de l’Iowa. Se reporter aux lignes directrices des CDC sur l’équipement et les procédures de travail avec des organismes BSL213. 1. Préparation des souches de Candida albicans Identifier une souche de référence appropriée à utiliser comme témoin positif. S’assurer que cette souche correspond étroitement aux souches expérimentales en termes de lignée et de manipulations génétiques.NOTE: Pour les expériences représentatives présentées ici, les mutants ont été créés à partir des souches décrites dans Homann, et al.14, qui ont été construites à partir de SN152. Ces mutants sont Arg-. Par conséquent, la souche de référence sélectionnée était SN250, qui a également été créée à partir de SN152 et est également Arg-. Les facteurs de stress nutritionnels sont essentiels dans la régulation de la croissance polarisée chez la levure Saccharomyces cerevisiae15; ils ont également été impliqués dans la filamentation chez C. albicans et d’autres champignons16,17,18. Par conséquent, la souche de référence doit être appariée pour les auxotrophies avec les souches expérimentales dans la mesure du possible afin d’éviter les effets confusionnels potentiels du stress nutritionnel. Choisissez des constructions d’expression de protéines fluorescentes. Lors du criblage d’une variété de souches expérimentales, créez une souche de référence qui exprime une protéine fluorescente et utilisez d’autres protéines fluorescentes pour marquer les souches mutantes.NOTE: Les données représentatives présentées ici utilisent NEON pour la souche de référence et iRFP pour les souches mutantes. Toute protéine fluorescente peut être utilisée si elle est fortement exprimée, relativement brillante et capable d’être excitée / détectée par le microscope utilisé. Les expériences de contrôle comparant des souches de référence qui expriment différentes protéines fluorescentes n’ont démontré aucun impact de l’expression des protéines fluorescentes sur la morphogenèse. Transformez les souches avec des constructions d’expression de protéines fluorescentes.REMARQUE : De nombreux établissements exigent l’utilisation de précautions de niveau de sécurité biologique 2 pour travailler avec C. albicans. Tous les travaux doivent respecter les règles de sécurité locales. Indépendamment des réglementations locales, les chercheurs travaillant avec C. albicans doivent être formés à la manipulation sécuritaire de l’organisme.Transformer les souches de référence et expérimentales à l’aide de protocoles standard d’acétatede lithium 19.NOTE: Les expériences décrites ici utilisent les plasmides pENO1-NEON-NAT R et pENO1-iRFP-NATR, généreusement fournis par le Dr Robert Wheeler 11,12. Les plasmides ont été linéarisés à l’aide de NotI9. Sélectionnez les transformants en fonction de la croissance sur la nourséothricine ou un autre milieu de sélection pertinent. Identifiez les transformateurs qui réussissent. Choisissez une petite noisette de cellules de chaque colonie à l’aide d’un cure-dent, puis mélangez-les en une gouttelette d’eau de 2,5 μL sur une lame de microscope. Appliquez une lame-couverture et examinez à un grossissement de 10x-40x. Examiner avec un système d’imagerie confocale (utilisé pour le reste du protocole) ou tout microscope à fluorescence à grand champ standard. Les transformants appropriés auront un signal lumineux avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées.REMARQUE: Pour les résultats représentatifs, les souches exprimant NEON ont été visualisées à l’aide d’un microscope à fluorescence verticale avec un filtre passe-long avec un filtre d’excitation passe-bande 472/30 nm, un filtre d’émission passe-bande 520/35 nm et un séparateur de faisceau dichroïque à bord unique de 495 nm. Étant donné que l’iRFP n’est pas visible à l’œil, les souches exprimant l’iRFP ont été visualisées à l’aide du système de microscopie confocale utilisé pour l’imagerie in vivo , en utilisant un laser de 638 nm pour l’excitation et la détection de la lumière d’émission de 655 à 755 nm.Vous pouvez également évaluer la fluorescence macroscopique des colonies à l’aide de la stéréomicroscopie de fluorescence, des systèmes d’excitation de fluorescence portatifs ou des systèmes de détection de fluorescence généralement utilisés pour les gels et les Western blots. Créer des stocks congélateurs de transformants sélectionnés. Inoculer le milieu solide YPD (extrait de levure peptone dextrose) avec une référence fluorescente exprimant une protéine et des souches expérimentales provenant de stocks de congélation 3 jours avant l’injection, en utilisant un cure-dent pour transférer une noisette d’organismes du stock congélateur au milieu solide YPD. Incuber à 30 °C pendant 2 jours. Pour chaque souche, inoculer une fiole contenant 25 mL de YPD avec des cellules de C. albicans prélevées dans plusieurs colonies 1 jour avant l’injection. Pour ce faire, utilisez un cure-dent pour transférer une noisette d’organismes d’une colonie dans le YPD; Répétez plusieurs fois pour obtenir des cellules de plusieurs colonies différentes. Incuber pendant une nuit à 30 °C dans un incubateur à agitateur orbital à 175 tr/min.REMARQUE : Il est important d’utiliser plusieurs colonies comme source pour l’inoculum, car C. albicans a une fréquence élevée d’altérations génétiques spontanées. L’utilisation de plusieurs colonies lors du début de la culture d’inoculum minimise le risque que tous les organismes de l’inoculum proviennent d’un parent présentant des altérations spontanées importantes. Le jour de l’injection :Centrifuger 1 mL de culture pendant 2 min à 500 x g. Lavez la culture trois fois avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (dPBS) stérile de Dulbecco. Après le lavage final, remettre en suspension la pastille dans 1 mL de dPBS stérile. Diluer un échantillon de la culture lavée à 1:100 et compter à l’aide d’un hémocytomètre. Ajuster la densité de la culture lavée à 1 x 108 organismes par mL à l’aide de dPBS. Pour chaque ensemble de souches à injecter, créer l’inoculum en mélangeant des volumes égaux de la souche de référence et de la ou des souches expérimentales. Cela maintient la densité de l’inoculum à 1 x 108 organismes par mL.REMARQUE : Le nombre de souches pouvant être évaluées par oreille est limité par la capacité du système de microscopie utilisé à distinguer clairement le signal de chaque protéine fluorescente. Une fois l’inoculum préparé, passez directement aux injections animales. Ne conservez pas l’inoculum avant utilisation. 2. Préparation des animaux Obtenir l’approbation du comité local de soin et d’utilisation des animaux de l’établissement ou de l’organisme directeur local concerné. Procurez-vous des souris âgées de 6 à 12 semaines auprès d’un fournisseur ou d’un programme d’élevage. Souris domestiques dans l’installation dans laquelle elles vivront tout au long de l’expérience pendant au moins 1 semaine avant l’inoculation.REMARQUE : Pour les résultats représentatifs, des souris DBA2/N femelles âgées de 6 semaines ont été utilisées. Nourrir les animaux sans chlorophylle pendant au moins 7 jours avant l’inoculation. 3. Épilation et inoculation Induire un plan chirurgical d’anesthésie (Figure 1).ATTENTION : Les agents anesthésiques inhalés sont des matières dangereuses et peuvent causer une irritation des yeux ou de la peau ainsi qu’une toxicité pour le système nerveux. Toutes les politiques et procédures de l’établissement et les pratiques générales de sécurité des laboratoires pour l’utilisation d’anesthésiques inhalés doivent être suivies. Seules les personnes formées à l’utilisation d’anesthésiques inhalés peuvent effectuer ces étapes. Les pratiques standard comprennent le port de gants, d’une blouse de laboratoire, d’une protection oculaire, l’utilisation d’un système de récupération d’anesthésie et une tenue minutieuse des dossiers conformément aux lignes directrices de l’établissement.Placez une souris dans une chambre d’induction d’anesthésie préchauffée. Gardez l’animal dans un environnement chaud tout au long de l’anesthésie générale. Pour ce faire, utilisez des coussinets chauffants conçus à cet effet et un étage de microscope chauffé. N’utilisez pas de coussin chauffant en vente libre, car il peut surchauffer et causer des brûlures. Fournir 2% à 3% d’isoflurane à la chambre d’induction jusqu’à ce que la souris ait perdu son réflexe de redressement et que les respirations soient lentes et régulières. Purger la chambre d’induction de l’anesthésie et transférer l’animal dans un cône nasal non recycleur fournissant 1% à 2% d’isoflurane. Valider le plan de l’anesthésie à l’aide du réflexe de pincement des orteils ou d’autres mécanismes de vérification. Tout au long de l’expérience, surveillez le schéma respiratoire et le plan anesthésique de l’animal, et ajustez la concentration anesthésique au besoin. Appliquez un lubrifiant pour les yeux pour prévenir la dessiccation cornéenne. Épilation (Figure 1C,D)Appliquez généreusement une crème dépilatoire en vente libre sur la surface interne et externe des deux oreilles à l’aide d’un coton-tige. Après 2-3 minutes (ou selon les instructions du fabricant), essuyez doucement l’oreille avec un tampon de gaze sec pour enlever toute la crème et les cheveux. Essuyez deux fois de plus avec des compresses de gaze saturées d’eau stérile pour éliminer complètement les résidus de crème dépilatoire. Le défaut d’enlever toute la crème dépilatoire entraînera une irritation / inflammation de la peau. Injection (figure 1E, F)Essuyez la surface de l’oreille à injecter avec un tampon de gaze saturé en éthanol à 70% et laissez sécher à l’air. Bien mélanger l’inoculum en l’inversant plusieurs fois ou en tourbillonnant. Aspirer 20 à 30 μL d’inoculum dans une seringue à insuline. En tenant l’aiguille pointée vers le haut, tapotez doucement la seringue pour vous assurer que tout l’air dans le canon est en haut. Éjectez soigneusement l’air et l’excès d’inoculum dans le tube d’inoculum ou un tube de déchets de sorte que le piston soit à la marque de 10 μL. En portant un dé à coudre sur un doigt ou un pouce de la main non dominante, stabilisez l’oreille en l’enroulant sur le dé à coudre. Vous pouvez également appliquer du ruban adhésif double face en vente libre (ruban adhésif de mode) sur un petit tube en plastique conique ou à fond rond et draper l’oreille sur le ruban. Prenez soin de ne pas déloger le cône nasal d’anesthésie pendant ce processus. Il peut être utile de coller le nez sur la surface de travail.REMARQUE: Le côté interne ou externe de l’oreille peut être injecté en fonction du confort physique de l’investigateur. Pour la microscopie, assurez-vous de placer la souris de manière à ce que le côté de l’oreille injectée soit orienté vers la lentille de l’objectif. En gardant l’aiguille de la seringue presque complètement parallèle à la peau et en évitant les grosses veines, insérez l’extrémité de l’aiguille dans la couche la plus externe de la peau jusqu’à ce que le biseau soit juste couvert. Injectez lentement l’inoculum par voie intradermique. Une bonne injection intradermique fera monter une petite bulle dans la peau. Gardez l’aiguille en place pendant 15 à 20 secondes avant de la retirer de l’oreille pour minimiser les fuites.Si le côté inférieur de l’oreille de l’animal devient humide, l’aiguille était trop profonde et passait entièrement à travers l’oreille. Dans ce cas, répétez l’injection dans une zone différente de l’oreille. Répétez le processus en utilisant l’autre oreille de l’animal. Cela peut être fait avec les mêmes souches de C. albicans pour une réplique ou avec un ensemble différent de souches de C. albicans. Si ce n’est pas l’imagerie immédiatement, placez l’animal dans une chambre de récupération chauffée. Observez l’animal jusqu’à ce qu’il se soit remis de l’anesthésie, puis retournez-le dans sa cage de logement. En suivant les protocoles institutionnels, marquer clairement la cage avec des étiquettes de danger biologique et indiquer que les animaux dans la cage sont infectés par Candida albicans. Remplir tous les dossiers requis liés à l’anesthésie animale et à toute autre pratique institutionnelle requise. Héberger l’animal dans des conditions animales en utilisant les précautions de niveau de sécurité biologique des animaux 2. 4. Quantifier la morphogenèse in vitro pour comparaison avec les résultats in vivo En utilisant les mêmes cultures lavées que celles utilisées pour préparer l’inoculum, créer une dilution 1:50 des organismes dans du sérum fœtal bovin inactivé à la chaleur RPMI1640 + 10% et incuber à 37 °C avec culbutage pendant 4 h. Alternativement, d’autres milieux qui stimulent la morphogenèse in vitro peuvent être utilisés. Centrifuger l’échantillon pendant 5 min à 500 x g et remettre en suspension dans 0,5 mL de dPBS. Diluer l’échantillon dans un rapport de 1:10, placer 2,5 μL de l’échantillon dilué sur une lame de microscope et le recouvrir d’une lame. Examiner l’échantillon à l’aide d’un microscope à fluorescence. Comptez au moins 100 cellules, en notant le nombre de cellules de levure et de filamenteuses pour chaque souche. Dans les résultats représentatifs présentés ici, une cellule filamenteuse est définie comme toute cellule d’une longueur supérieure à deux fois la longueur de la cellule mère.NOTE: La quantification de la morphogenèse in vitro peut être effectuée le même jour que l’inoculation des animaux. Il est possible de lancer le test de morphogenèse in vitro tout en préparant l’inoculum pour l’injection et d’effectuer l’inoculation des animaux pendant la période d’incubation de 4 heures. Si toutes les procédures animales sont terminées avant la fin de la période d’incubation de 4 heures, procéder directement à l’examen des cellules stimulées in vitro . Alternativement, les cellules peuvent être remises en suspension dans du formaldéhyde à 3,7% dans du dPBS (à l’étape 4.2) et stockées à 4 °C pendant plusieurs jours. Les organismes fixes peuvent ensuite être quantifiés si le temps le permet. L’inoculation des animaux ne doit pas être retardée pour l’essai de quantification in vitro . 5. Préparation à l’imagerie in vivo Préparez le microscope (Figure 2A).Allumez tout l’équipement de microscopie et démarrez le logiciel d’imagerie.Si disponible, chargez tous les paramètres d’imagerie prédéterminés. Activer les lasers et les détecteurs nécessaires pour détecter les protéines fluorescentes utilisées. Allumez l’étage du microscope chauffé et laissez-le chauffer à 37 °C.NOTE: Il est possible d’utiliser un microscope avec une chambre environnementale entièrement fermée plutôt qu’une platine chauffée. Définissez un point de référence de l’axe z dont le plan de mise au point se trouve sur la surface supérieure de la lamelle de couverture.  Cela peut être fait en collant un bordereau de couverture en place sur l’ouverture de la scène et en mettant une gouttelette d’eau sur le couvercle.  Utilisez un objectif « sec » à faible grossissement (10x) pour effectuer la mise au point sur le bord de la gouttelette d’eau, puis définissez le point de référence de l’axe z.  Utilisez un morceau de serviette pour absorber l’eau de la lamelle de couverture avant de la retirer de la scène. Faites pivoter l’objectif à très longue distance de travail et placez une gouttelette de liquide d’immersion sur l’objectif. Abaissez l’objectif pour éviter d’éventuels dommages lors de la pose de la lame. Placez un capset #1.5 sur l’ouverture de la scène et collez-le en place. Assurez-vous que le ruban recouvre complètement tous les bords de la lamelle de couverture pour empêcher tout fluide de pénétrer sous la lamelle de couverture dans le microscope. Placez l’objectif au point de référence de l’axe z afin que le fluide d’immersion soit en contact avec la lentille de l’objectif et la lamelle de couverture. Préparez plusieurs morceaux de ruban adhésif sensible à la pression afin qu’ils soient prêts à l’emploi lors du positionnement du nez et de la souris. Induire une anesthésie générale chez la souris à imager comme ci-dessus (étape 3.1). Positionnez la souris (Figure 2B-D).Fixez un cône nasal d’anesthésie sur la scène du microscope avec le nez positionné de manière à couvrir complètement le nez de l’animal lorsque celui-ci est en position pour l’imagerie. Cela peut être accompli plus facilement avec deux enquêteurs. Demandez au premier chercheur de placer le nez de la souris anesthésiée dans le nez et de déplacer la souris en position pour l’imagerie tout en continuant à tenir le nez au-dessus du nez de l’animal. Demandez à l’autre enquêteur de scotcher le nez et le tube en place de manière à ce qu’ils reposent de manière stable sur le nez de la souris. Une fois que le nez est collé en place, laissez-le là pour le reste de la séance d’imagerie. Après avoir établi le meilleur endroit pour placer le nez, notez sa position. Pour les séances d’imagerie ultérieures, le nez peut être fixé à la scène avant d’amener un animal au microscope. Placez une goutte d’eau stérile sur la lamelle de couverture au-dessus de la lentille de l’objectif. Placez la souris sur la platine du microscope. Assurez-vous que l’oreille est au-dessus de la gouttelette d’eau et à plat contre la lamelle de couverture. Utilisez un deuxième couvercle (supérieur) pour aplatir l’oreille.Placez le bord de la lamelle de couverture parallèle au corps de la souris, le bord touchant la souris à l’endroit où l’oreille rencontre la tête. Abaissez le bord libre de la lamelle de couverture jusqu’à l’étage du microscope avec un mouvement de charnière. Comme le capot vient contre l’étage du microscope, il aplatira l’oreille. Veillez à ne pas créer de plis ou de crêtes dans l’oreille. Collez le couvercle supérieur en place de manière à ce qu’il maintienne juste assez de pression pour maintenir l’oreille à plat. Veillez à ne pas attraper les poils ou les moustaches de la souris dans la bande. À moins qu’un microscope avec une chambre environnementale ne soit utilisé, couvrez lâchement le corps de la souris avec un champ stérile pour maintenir un environnement normothermique. Identifiez un domaine d’intérêt.Assurez-vous que l’objectif se trouve au point de référence de l’axe z. À l’aide de la lumière blanche/imagerie à grand champ, ajustez le plan de mise au point dans le tissu de l’oreille. Une bonne stratégie consiste à se concentrer sur les vaisseaux sanguins – si l’on peut voir les globules rouges se déplacer dans les vaisseaux sanguins, le plan de focalisation est à l’intérieur du tissu. Si le microscope est équipé d’une capacité de fluorescence à grand champ, utilisez-le pour identifier un champ d’intérêt. Si ce n’est pas le cas, utilisez l’imagerie confocale. En général, l’utilisation de la microscopie à grand champ pour identifier les zones d’intérêt est plus rapide et nécessite moins d’irradiation du tissu de l’oreille.À l’aide d’un cube filtrant pour la détection de la protéine fluorescente exprimée dans la souche de référence, identifiez un champ de vision qui a un signal fluorescent de la souche de référence. Gardez à l’esprit qu’une lumière floue empêchera probablement la capacité de se concentrer sur des organismes individuels. Le but de cette étape est d’identifier un domaine d’intérêt pour l’imagerie confocale. Passez à un cube filtrant qui détectera la protéine fluorescente exprimée par la ou les souches expérimentales et vérifiera leur présence dans le champ de vision sélectionné. 6. Imagerie Déterminez les paramètres.Lorsque le logiciel d’imagerie est en mode confocale en direct, examinez le champ d’intérêt lorsque le plan focal est déplacé sur l’axe z. Choisissez un plan de l’axe z avec un signal fort de toutes les protéines fluorescentes utilisées. Ajustez la puissance du laser et/ou la vitesse d’imagerie pour obtenir un signal suffisamment fort pour que la morphologie puisse être déterminée pour toutes les cellules du champ de vision. Pour éviter les dommages tissulaires, utilisez la puissance laser la plus faible possible.REMARQUE: Comme pour toute imagerie, il existe un équilibre entre la puissance laser, la vitesse d’acquisition et la résolution. Identifier les paramètres qui identifient clairement la morphologie de l’organisme tout en équilibrant la vitesse et la puissance laser pour minimiser l’irradiation du tissu de l’oreille. Étant donné que l’imagerie se produit à travers le derme externe, une puissance laser plus élevée est requise pour l’excitation que ce qui est généralement nécessaire pour l’imagerie confocale d’échantillons traditionnels montés sur des lames. Heureusement, le niveau de résolution spatiale requis pour l’analyse de la morphologie n’est pas extrême. Ainsi, il est facilement possible d’obtenir des images avec un signal suffisant pour déterminer la morphologie de l’organisme sans causer de lésions tissulaires. Une fois ces paramètres établis, utilisez-les tout au long de la session d’imagerie pour servir de point de départ aux séances d’imagerie suivantes. Il est donc utile d’enregistrer les paramètres d’imagerie.REMARQUE: Les zones individuelles d’infection peuvent être moins profondes ou plus profondes dans le tissu. Les zones plus profondes peuvent nécessiter une augmentation de la puissance laser. Étant donné que ce test repose sur la distribution spatiale du signal plutôt que sur son intensité, il est acceptable de modifier les paramètres d’image entre les champs au besoin. Obtenez les images.Choisissez un champ de vision qui présente une formation de filament claire dans la souche de référence et où la plupart des organismes sont suffisamment dispersés pour que leur morphologie puisse être déterminée. Définissez les plans de mise au point supérieur et inférieur d’une pile z. Il n’est pas nécessaire de couvrir toute la profondeur de la zone infectée, mais gardez à l’esprit que les organismes situés en haut ou en bas du volume imagé sont généralement exclus de l’analyse. Acquérir des images z-stack, pseudo colorer chaque canal pour distinguer chaque souche et superposer les canaux. Enregistrez les images. Répétez l’opération pour les autres champs de vision. La morphogenèse peut varier d’un endroit à l’autre; Par conséquent, il est important d’acquérir et d’analyser au moins trois champs de chaque oreille. 7. Analyse bidimensionnelle manuelle : fréquence de filamentation Utilisez un logiciel d’imagerie pour effectuer une projection maximale de la pile z dans une image bidimensionnelle. Les instructions fournies ici sont pour FIJI/Image J.Ouvrez des images de microscopie à l’aide du logiciel ImageJ. Si nécessaire, appliquez une pseudo-couleur sur chaque canal pour permettre une identification simple de chaque souche de C. albicans. Pour cela, cliquez sur Image > Lookup Table > LUT Color et sélectionnez la pseudo-couleur choisie. Convertissez le fichier de pile en une image bidimensionnelle de projection d’intensité maximale :Sélectionnez le fichier z-stack. Cliquez sur Image > Stacks > Z Projection. Sélectionnez les plans supérieur et inférieur et sélectionnez le type de projection Intensité maximale. Compter chaque organisme vu dans les images de projection maximale par type de souche (distingué par la couleur du canal) et la morphologie.Les organismes qui se chevauchent considérablement ou les zones à très forte densité d’organismes seront difficiles à compter avec précision. Excluez-les du dénombrement, mais veillez à ne pas introduire de biais contre les formes filamenteuses, qui sont plus susceptibles de se chevaucher. Les formes filamenteuses projetant directement dans ou hors de la pile z apparaîtront comme de petits objets ronds dans une projection maximale. De même, les organismes qui sont coupés par la bordure de l’image peuvent sembler être de la levure parce que le filament est hors du champ de vision. Ainsi, l’analyse bidimensionnelle surestimera toujours le pourcentage de formes de levure. Comme cela se produira de la même manière avec la souche de référence et la souche expérimentale, comparez toujours les résultats expérimentaux à ceux d’une souche de référence. Effectuer des comparaisons statistiques des résultats dictées par le plan expérimental. 8. Analyse bidimensionnelle manuelle : longueur du filament Pour C. albicans, la formation aberrante de filaments peut se produire parce que: a) moins de cellules de levure « mères » subissent une morphogenèse, b) les filaments se développent à un rythme plus lent, ou c) la croissance filamenteuse est initiée mais non maintenue. Pour évaluer ces possibilités, quantifier la longueur du trajet de la courbe de chaque filament dans l’image de projection maximale comme substitut de la longueur tridimensionnelle réelle (discutée ci-dessous).Lorsqu’un bourgeon se développe sur une cellule mère, il n’est pas possible de dire s’il deviendra un filament ou une levure. Pour vous assurer que seules les cellules filamenteuses sont incluses dans cette analyse, mesurer uniquement les organismes dans lesquels la cellule fille est au moins deux fois plus longue que la cellule mère. Ouvrez l’image de projection maximale créée à l’étape 7. Dans le jeu d’outils ImageJ, cliquez avec le bouton droit sur l’outil Ligne droite/segmentée et choisissez l’option Ligne segmentée. L’option de ligne segmentée permet à l’utilisateur de mesurer la longueur du filament le long d’un chemin courbe, une nécessité compte tenu de la plasticité des filaments de C. albicans. Mesurez la longueur du filament du col du bourgeon à l’extrémité croissante du filament. Faites un clic gauche sur le col du bourgeon; Le pointeur se transforme en un petit carré. Tracez le filament le long de sa longueur, en cliquant sur le centre du filament chaque fois qu’il y a une courbe, un tour ou un changement de l’axe long du filament. Double-cliquez à l’extrémité croissante du filament. Appuyez sur Ctrl + M. Cela ouvrira une fenêtre contextuelle qui tabulera les mesures de surface, moyenne, min, max et longueur. Après avoir mesuré chaque filament, appuyez à nouveau sur Ctrl + M pour ajouter la mesure actuelle au tableau des mesures. Lorsque tous les filaments ont été mesurés, copiez et collez les mesures de longueur dans un fichier d’analyse de données. Effectuer une analyse statistique pour évaluer la distribution des longueurs de filament dans la souche de référence et la souche mutante. 9. Analyse tridimensionnelle manuelle Pour obtenir une mesure plus précise de la morphogenèse qui évite la surestimation des formes de levure et peut permettre la discrimination entre pseudohyphes et hyphes, faites défiler manuellement la pile z de haut en bas tout en évaluant la morphologie de chaque organisme en trois dimensions. Vous pouvez également créer une image tridimensionnelle de chaque pile Z et analyser la forme de chaque organisme tout en faisant pivoter l’image. 10. Analyse automatisée À l’aide du logiciel d’imagerie, automatisez le dénombrement des organismes et leur morphologie en deux ou trois dimensions.NOTE: Certains algorithmes pour la discrimination des types morphologiques peuvent introduire un biais. Ainsi, les stratégies d’automatisation doivent être soigneusement validées par rapport à la conception expérimentale. Une analyse d’image automatisée bien conçue et validée peut augmenter le débit de l’étape d’analyse.