使用口面部操作性疼痛测定法评估大鼠神经损伤诱导的机械超敏反应

所有实验程序均由佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南中规定的标准。在这里，使用OPAD评估机械超敏反应是使用神经性口面部疼痛的大鼠模型描述的。研究中使用的时间线示意图如图 1所示。所有行为评估均由女性实验者进行。 1. 动物 在温控室（22°C ± 1°C）中成对地将雌性Sprague-Dawley大鼠（n = 8 /组，150-200g）成对地进行12小时：12小时的明暗循环。 随意提供食物和水。在实验前将大鼠留在设施中5天以进行适应。 在一周的同一天和时间（上午9点至上午11点）进行操作性疼痛测定。 在实验结束时，在异氟烷麻醉后通过斩首对大鼠实施安乐死。 2. 设置操作程序 将滴漏牛奶托盘、Plexiglas笼和金属地板炉排放在 OPAD 上。将电线连接到笼子上。将瓶架滑到设备背面的金属杆上。 打开一罐加糖炼乳并将其倒入 1 L 烧杯中，准备 2：1 比例的水与加糖炼乳作为奖励溶液。将 ~600 mL 自来水加入 300 mL 牛奶中。最初用勺子搅拌溶液，然后使用搅拌棒和热板搅拌器。然后，用牛奶溶液填充奖励瓶，并将牛奶溶液保持在4°C。注意：用塑料食品包装覆盖牛奶溶液。每次使用前加热牛奶溶液。冰箱中的牛奶溶液可以在一周后凝结。当它凝固时，它可能会阻塞舔管。因此，丢弃它并准备新的储备溶液。 将奖励奶瓶放在瓶架上并调整它们，以便动物可以接触到喷嘴。拧紧支架的左侧旋钮，将瓶子固定到位。 使用前面板上的开关打开固定架。 3. 设置实验方案和创建实验文件 注意：首先，设置协议以运行实验。该协议描述了ANY-maze软件如何执行实验。 打开软件。键入密码。单击“ 登录我 ”或按 回车键。 点击 新建空实验|协议 菜单。选择此协议将使用的模式并命名该协议。在“设备”下，单击“未命名协议”，单击“选择此协议将使用的模式”部分，然后在“设备特定模式”下，选择“OPAD 机械笼模式”，然后单击“确定”。然后，将协议命名为机械协议（例如，OPAD 机械）。 添加OPAD笼子。在“设备”下，单击“设备|添加在“协议”窗格顶部找到的项目|新型OPAD笼|添加所有连接的 OPAD 笼子。注意：在添加保持架之前，请确保所有保持架都已打开。 添加实验测试阶段。在“测试”下，单击“阶段|第一阶段和名称阶段（例如，基线第 1 天）。键入 10 分钟作为测试持续时间。要添加更多阶段，请单击协议窗格顶部的添加项目|新舞台。注意：每个阶段是指执行测定的会话。例如，对于 10 天的培训，需要 10 个阶段。测试持续时间可以根据实验设计增加或减少。 分配治疗组。在 “其他信息”下，单击 “处理组”。选中 使用治疗组|用户将手动将动物分配到他们的组。注意：参考的软件（见 材料表）还允许随机或按特定顺序分配动物。实验可以盲目进行。要查看分配的治疗组，请取消选中 盲运行实验。 分配动物标识 （ID）。单击 协议 菜单;在“ 其他信息”下，单击“ 动物 ID ”，然后选中 “使用我的 ID 来指代动物”。 点击 实验 菜单。键入实验标题。 通过单击查看治疗来命名治疗，然后键入治疗名称（例如， 治疗 1：CCI-ION，治疗 2：假治疗）。 添加动物并通过点击查看动物|来分配治疗和 动物 ID添加动物，输入要测试的动物数量 ，然后单击确定。等待动物列表出现，并为每只大鼠添加动物ID和治疗方法。注意：在研究开始时，动物ID旁边显示 的状态列表 将设置为 正常 。稍后可以通过将动物的状态更改为“ 已停用 ”或 “已删除”来将其从测试计划中删除。 通过单击协议菜单保存 协议 | 保存 协议位于“ 协议 ”窗格顶部。键入 文件名 和软件（ANY-迷宫）密码，然后单击 保存。注意：保存的方案可以重新用于新实验。 通过单击“文件|”保存实验 文件保存，键入软件密码，然后单击 保存。 4. 培训和基线测试课程 注意：如果行为测试室位于同一动物饲养设施中，则在测试前至少 15 分钟将大鼠带到房间。如果将它们运送到动物设施外的测试室，给大鼠1小时以适应房间。 在基线记录之前，训练OPAD中的大鼠2周（5天/周，10分钟/天），将它们的脸压在金属尖刺棒上以接受牛奶溶液。注意：加标棒和执行测定的大鼠的代表性图像如图 2所示。 设置 OPAD 设备。 使用前面板上的开关打开固定架。寻找笼子上的绿灯，这意味着笼子已准备好进行测试。 双击保存的实验文件以打开。键入密码。单击“ 登录我 ”或按 回车键。 等待 “测试 ”菜单出现。在屏幕左侧，记下动物的数量和相应的笼子（例如，动物 1 将在笼子 1 中进行测试）、当天将运行的阶段以及测试状态（“就绪”）。在屏幕的右侧，观察每只动物的图表，其中显示了舔舐和接触的数量。 观察显示待测动物ID的笼子屏幕。将每只老鼠放入相应的笼子中，然后按两次笼子上的按钮。请注意，测试开始后，绿灯将变为橙色指示灯，测试会话结束时将听到警告声。 在训练的前两天，将牛奶瓶完全放入笼子中，让大鼠在不接触刺激物的情况下喝牛奶。 在训练的第3-8天，一旦动物开始喝水，将瓶子逐渐向后移动，以鼓励老鼠将脸压在带刺的棒上。 在训练的第9-10天，一旦动物完全压在带刺的棒上并且舔舐次数一致（在10分钟的测试过程中至少舔500次），记下每只动物的奶瓶位置，并使用此距离进行基线记录。 训练 2 周后，从记录的牛奶瓶距离收集 5 天的数据作为基线（10 分钟/天）。 5.口面部神经性疼痛的诱导和机械超敏反应的评估 注意：基线测量后，大鼠接受了CCI-ION手术，该手术涉及离子的双侧结扎，如前所述20。对照大鼠进行了假手术。手术中没有使用术前或术后镇痛，因为它可以改变神经病变的时间进程。注意：废物异氟烷必须通过木炭罐清除。手术刀刀片和针头必须丢弃在生物危害废物中。 用O2 （1L / min）和4%异氟醚的混合物在诱导室中麻醉大鼠，并在手术期间用专门的鼻锥维持麻醉状态。 将麻醉的大鼠放在手术工作台上并约束它。使用加热垫将体温保持在37°C。在眼睛上涂抹眼药膏，以防止它们变干。通过捏住脚趾检查麻醉深度，并在不再观察到脚趾撤回反射时开始手术。 在体视显微镜下进行外科手术。使用牵开器打开嘴巴，然后用小夹子收回嘴唇。 使用手术刀刀片在牙龈背侧和嘴唇之间做一个小切口（#15）。使用手术刀刀片的尖端轻轻切开软组织，露出离子的分支。 使用钝的弯曲注射器针头在离子周围放置两个铬肠 （#5-0） 结扎。 使用纸巾粘合剂闭合伤口。 对于假手术，使用相同的程序暴露离子，但不要结扎神经。 手术后，提供牛奶软化的啮齿动物食物2天，以鼓励进食并防止脱水。 手术后第二天在OPAD中测试大鼠连续3天，然后每周3天（例如，每周二，周四和周五）在接下来的几周内测试，直到舔数量达到其基线值。注意：CCI-ION诱导的机械敏感性的持续时间可能取决于性别，所用啮齿动物的应变以及实验者的表现。因此，指出测试动物的一定持续时间可能不准确。因此，直到舔数量达到基线值进行测试更准确。 6. 清理设备 测试完成后，单击右上角的 x 图标退出软件，然后等待数据自动保存。 使用前面板上的开关关闭固定架。 从金属地板格栅上拔下电线。取出并清洗滴牛奶托盘、Plexiglas笼、金属地板格栅和用洗洁精的瓶架。把所有东西都放在晾衣架上。 使用 70% 异丙醇擦拭金属加标棒、测试设备和实验室工作台。注意：仪器需要小心处理。清洁牛奶瓶和舔管时使用软刷。肮脏的设备会导致细菌积聚。 7. 数据分析 双击实验文件将其打开。 单击 结果 菜单。选择要查看的度量（即舔、接触）或测试天数。 单击“结果”面板顶部的“文本”、“图形”或“统计”以查看文本、图形或统计分析报告。 要查看原始数据，请单击“ 数据 ”菜单。单击“数据”面板顶部的 “保存 ”将数据另存为电子表格，或单击 “发送 ”通过电子邮件接收数据。 要更改或添加更多变量以查看，请单击选择 数据，选择度量，然后单击 查看电子表格。 统计分析自动从软件中获取舔和接触的数量以及第一次舔的延迟，并将数据从软件导出到电子表格。 通过将舔次数除以接触次数21，22，23，计算 L/F 比率作为超敏反应指数。注意：在这项研究中，假手术组中的一只大鼠由于手术前舔舐次数少（<500次舔）而被排除在研究之外。 通过双向重复测量方差分析分析L/F、舔次数和接触点之间差异的统计意义，以及第一次舔舔的潜伏期，然后在适当的情况下进行邓内特多重比较或Šídák多重比较检验。注：P < 0.05被认为具有统计学意义。数据以平均值±平均值的标准误差（SEM）表示。