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Neurowissenschaften

Auswertung und Manipulation neuronaler Aktivität mittels holographischer Zwei-Photonen-Mikroskopie

Published: September 16, 2022
doi:
10.3791/64205
, , , , , , ,
1Department of Anatomy and Molecular Cell Biology,Nagoya University Graduate School of Medicine, 2Division of Multicellular Circuit Dynamics, National Institute for Physiological Sciences,National Institutes of Natural Sciences, 3Department of System Science,Kobe University Graduate School of System Informatics, 4Department of Biology, Graduate School of Sciences,Kobe University, 5Department of Information Science,Kobe University Graduate School of System Informatics, 6Center of Optical Scattering Image Science,Kobe University

Summary

Wir haben ein holographisches Zwei-Photonen-Mikroskop entwickelt, das neuronale Aktivität mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung visualisieren, beurteilen und manipulieren kann, mit dem Ziel, die Pathogenese neuropsychiatrischer Erkrankungen aufzuklären, die mit abnormaler neuronaler Aktivität assoziiert sind.

Abstract

Jüngste Fortschritte in der optischen Biobildgebung und Optogenetik haben die Visualisierung und Manipulation biologischer Phänomene, einschließlich zellulärer Aktivitäten, bei lebenden Tieren ermöglicht. Auf dem Gebiet der Neurowissenschaften wurden nun detaillierte neuronale Aktivitäten im Zusammenhang mit Gehirnfunktionen wie Lernen und Gedächtnis aufgedeckt, und es ist möglich geworden, diese Aktivität künstlich zu manipulieren, um Gehirnfunktionen auszudrücken. Die konventionelle Auswertung der neuronalen Aktivität mittels Zwei-Photonen-Ca2+ -Bildgebung hat jedoch das Problem der geringen zeitlichen Auflösung. Hinzu kommt, dass die Manipulation der neuronalen Aktivität durch die konventionelle Optogenetik durch die optische Faser nur gleichzeitig die Aktivität von Neuronen mit dem gleichen genetischen Hintergrund regulieren kann, was es schwierig macht, die Aktivität einzelner Neuronen zu kontrollieren. Um dieses Problem zu lösen, haben wir kürzlich ein Mikroskop mit einer hohen räumlich-zeitlichen Auflösung für biologische Anwendungen entwickelt, indem wir Optogenetik mit digitaler holografischer Technologie kombinieren, die Femtosekunden-Infrarot-Laserstrahlen modifizieren kann. Hier beschreiben wir Protokolle für die Visualisierung, Auswertung und Manipulation neuronaler Aktivität, einschließlich der Vorbereitung von Proben und des Betriebs eines holographischen Zwei-Photonen-Mikroskops (Abbildung 1). Diese Protokolle liefern genaue raumzeitliche Informationen über die neuronale Aktivität, die für die Aufklärung der Pathogenese neuropsychiatrischer Störungen, die zu Anomalien in der neuronalen Aktivität führen, nützlich sein können.

Introduction

Die Zwei-Photonen-Ca2+-Bildgebung ist eine nützliche Technik zur Beurteilung der neuronalen Aktivität. Es kann verwendet werden, um nicht nur die neuronale Aktivität zu identifizieren, die für Verhalten und Gedächtnis bei normalen Tieren erforderlich ist 1,2, sondern auch eine abnorme neuronale Aktivität, die in Mausmodellen für neuropsychiatrische Erkrankungen auftritt 3,4. Die Technik wurde verwendet, um die neuronalen Grundlagen von Gehirnfunktionen aufzuklären. Obwohl sie hochauflösende und qualitativ hochwertige Bilder liefern kann, ist ihre zeitliche Auflösung geringer als die der elektrophysiologischen Methode 1,3.

Die Optogenetik hat dazu beigetragen, die Art und Weise, wie Neurowissenschaftler die Gehirnfunktion verstehen, zu erneuern5. Angesichts der technischen Einschränkungen hat die Mehrheit der optogenetischen Forschung Aktivierungsschemata mit geringer räumlicher Auflösung verwendet, wodurch die Arten von Manipulationen der neuronalen Aktivität, die entsprechend durchgeführt werden können, eingeschränkt werden. Die Manipulation neuronaler Aktivität auf feineren raumzeitlichen Skalen kann jedoch möglicherweise nützlich sein, um ein umfassenderes Verständnis der neuronalen Berechnung und der Pathogenese neuropsychiatrischer Erkrankungen zu erlangen. Eine räumlich präzise holographische Technologie, die Laserstrahlen im nahen Infrarotbereich im Femtosekundenbereich formen kann, verspricht, diese Herausforderung zu meistern und eröffnet mehrere neue experimentelle Klassen, die bisher nicht möglich waren 6,7. Diese Technologie ermöglicht es Neurowissenschaftlern, die grundlegenden Aspekte und Pathologien sensorischer, kognitiver und verhaltensbezogener neuronaler Codes aufzudecken, die bisher unerreichbar waren.

Bei der holografischen Projektion werden gewünschte Lichtmuster erzeugt, um gezielt auf einzelne Zellen und funktionelle Netzwerke zugreifen zu können. In-vivo-Experimente erfordern eine optimale Lichtdurchlässigkeit, um Zellen im lebenden Gehirn anzusprechen. Infrarotlicht dringt tiefer in lebendes Gewebe ein und kann für die nichtlineare Zwei-Photonen-Anregung (2PE) verwendet werden8,9,10. So kann die holographische Zwei-Photonen-Mikroskopie, die holographische Projektion und 2PE kombiniert, verwendet werden, um neuronale Aktivitäten zu bewerten und zu manipulieren, um zelluläre und funktionelle Netzwerke in vivo zu untersuchen. Jüngste biologische Anwendungen der holographischen Zwei-Photonen-Mikroskopie haben die neuronale Aktivität und die Schaltkreise aufgeklärt, die für das Lernen im visuellen Kortex11, 12, Riechkolben 13 und Hippocampus14 erforderlich sind.

Zahlreiche Labore weltweit berichten von aufregenden Ergebnissen und Verbesserungen mit ihren holographischen Stimulationssystemen 15,16,17,18,19,20,21,22,23. Bei dem hier beschriebenen System kann das holographische Stimulationssystem als Zusatzgerät für ein herkömmliches Mikroskop aufgebaut werden. Der Phasen-Phasen-Raumlichtmodulator (SLM) ist das Schlüsselgerät für die Modulation einer ebenen Wellenfront in eine beliebige Form, und der Interferenzeffekt wird verwendet, um die Intensität und Position der Brennpunkte zu steuern. Abbildung 2 zeigt holographische Stimulation und bildgebende Lichtwege. Der erste Strahlengang ist für den Punkt-Scanning-Bildgebungsmodus vorgesehen und besteht aus einem Scankopf und Bilddetektoren. Der zweite Strahlengang dient der holographischen Stimulation mit einer Wellenlänge von 1040 nm und besteht aus einem SLM1. Der dritte Strahlengang ist für die holographische Beleuchtung mit 920 nm Wellenlänge vorgesehen und besteht aus einem SLM2 und einem Bildsensor. Der holografische Bildgebungsmodus kann Intensitäten aus mehreren Bereichen von Interesse aufzeichnen, indem mehrere Punkte in der Probe beleuchtet werden. Auf diese Weise kann die Aufnahmegeschwindigkeit auf einige hundert Bilder pro Sekunde erhöht werden. Um eine punktuelle Bildgebung oder holographische Beleuchtungsbildgebung zu erreichen, wurde der 920-nm-Laser durch einen Strahlteiler mit einem festen Verhältnis von 3:7 in zwei Pfade aufgeteilt. Alle optischen Elemente wurden auf einem optischen Steckbrett mit den Abmessungen 600 mm × 600 mm ausgerichtet. Das modulierte Licht trat durch die Lichtöffnung an der Seite des mikroskopischen Körpers ein, während das punktuelle Abtastlicht durch den Scankopf an der Oberseite des mikroskopischen Körpers eintrat. Diese Leuchten wurden direkt über der Objektivlinse integriert und erzeugten Brennpunkte in der Probenebene. Darüber hinaus ermöglichte die maßgeschneiderte Software einen einfachen und konsistenten Ablauf des regulären Arbeitsablaufs.

In diesem Artikel wird ein vollständiges Protokoll für die Verwendung von holographischer Stimulation oder Beleuchtung zur Messung der neuronalen Aktivität und zur Bewertung der funktionellen Konnektivität zwischen Neuronen vorgestellt. Zu Demonstrationszwecken beschreiben wir hier eine Hirnoperation, die auf den Hintergliedmaßenbereich des primären somatosensorischen Kortex (S1HL) des Mausgehirns abzielt, und eine Methode zur Beurteilung und Manipulation der neuronalen Aktivität mittels holographischer Zwei-Photonen-Mikroskopie. Das experimentelle Verfahren gliedert sich in vier Teile. Zunächst wurde die Kopfplatte mit Zahnzement am Schädel der Maus befestigt. Zweitens wurde ein viraler Vektor, der jGCaMP8f oder GCaMP6m-P2A-ChRmine exprimiert, stereotaktisch in den S1HL injiziert. Drittens wurde das holographische Stimulations- bzw. Beleuchtungssystem kalibriert. Viertens wurde nach postoperativer Genesung und Expression dieser beiden Proteine eine in vivo Ca2+ Bildgebung durchgeführt, um die neuronale Aktivität und funktionelle Konnektivität zwischen Neuronen mit holographischer Zwei-Photonen-Mikroskopie zu untersuchen.

Protocol

Alle Versuchsprotokolle wurden von den Animal Care and Use Committees der Nagoya University Graduate School of Medicine genehmigt (Zulassungsnummer: M220295-003). 1. Implantation der Kopfplatte (Abbildung 1A) Verabreichen Sie das Anästhetikum (eine Mischung aus 74 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin) intraperitoneal, um die Maus zu betäuben. Überprüfen Sie den Anästhesiestatus der Maus regelmäßig, indem Sie die Pedalreflexe beurteilen. Setzen Sie die Maus nach der Narkose in ein stereotaktisches Instrument. Tragen Sie eine Augensalbe auf (siehe Materialtabelle), um ein Austrocknen der Hornhaut bei der Implantation der Kopfplatte zu verhindern. Rasieren Sie den Operationsbereich und desinfizieren Sie die Haut mit drei abwechselnden Runden Povidon-Jod- oder Chlorhexidin-Peelings, gefolgt von Tüchern mit 70 % Alkohol. Legen Sie den Schädel vorsichtig frei und reinigen Sie ihn mit Wattestäbchen.Anmerkungen: Alle chirurgischen Instrumente sollten sterilisiert und alle Eingriffe entsprechend durchgeführt werden. Verbleibende Ablagerungen (z. B. Haare oder getrocknetes Blut) verursachen Entzündungsreaktionen. Daher sollten alle Ablagerungen unter einem Stereoskop mit Wattestäbchen entfernt werden, die mit sterilem Wasser oder 70%igem Alkohol angefeuchtet sind. Verwenden Sie die stereotaktischen Koordinaten – anterior und posterior = 0,5 mm, medial und lateral = 1,5 mm von Bregma -, um das Zentrum der Kraniotomie zu finden, und beschriften Sie es mit einem Filzstift. Platzieren Sie eine speziell angefertigte Kopfplatte in der Mitte des Schädels. Tragen Sie als Nächstes Zahnzement auf (siehe Materialtabelle), um ihn fest am Schädel zu befestigen. Üben Sie leichten Druck aus, bis die Kopfplatte festen Kontakt mit der Vorder- und Rückseite des Schädels hat.HINWEIS: Dieser Schritt dauert ca. 20 Minuten und ist entscheidend für die Reduzierung von Bewegungsartefakten im Gehirn während der Zwei-Photonen-Bildgebung. Die Abmessungen der Kopfplatte betragen 20 mm × 40 mm × 1 mm mit einer Öffnung in Form einer Grundplatte mit einer Kante von 15 mm Länge, zwei benachbarten Seiten von 3 mm Länge und den restlichen beiden Seiten von 10 mm Länge. Mischen Sie einen Dentalkleberzement auf Acrylbasis wie folgt zusammen: einen halben Löffel Pulver, drei Tropfen Flüssigkeit und einen Tropfen Katalysator (siehe Materialtabelle). Um ein Austrocknen zu verhindern, tragen Sie diesen gemischten Dentalkleber mit der Kopfplatte auf die intakte Schädeloberfläche der Maus auf. Legen Sie die Maus in einen warmen Käfig, bis sie sich von der Narkose erholt hat. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein zu halten. 2. Operation und Injektion des Adeno-assoziierten Virus (AAV) (Abbildung 1B) Führen Sie 1 Tag nach der Implantation der Kopfplatte eine Kraniotomie oder Virusinjektion durch, ohne den Zahnkleberzement aus dem Schädel zu entfernen.HINWEIS: Verabreichen Sie der Maus während dieses Verfahrens eine Anästhesie (eine Mischung aus 74 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin) intraperitoneal. Um ein Hirnödem zu vermeiden, wird 1 h vor der Operation Dexamethason-Natriumphosphat (1,32 mg/kg) intraperitoneal verabreicht. Betäuben Sie die Maus mit der Kopfplatte mit 1%iger Isofluran-Anästhesie unter Verwendung eines Verdampfers (Anästhesie-Verabreichungssystem) und halten Sie die Körpertemperatur mit einem Heizkissen aufrecht. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Führen Sie unter einem Stereoskop eine kreisförmige Kraniotomie mit einem Durchmesser von ca. 2 mm mit einem Zahnbohrer durch. Um Hirnschäden zu reduzieren, bedienen Sie den Zahnbohrer vorsichtig mit konstanter leichter Bewegung und leichtem Druck nach unten. Entfernen Sie Knochenfragmente mehrmals mit einem Absaugsystem. Verwenden Sie nach der Entfernung der Knochenfragmente eine künstliche Rückenmarksflüssigkeitslösung (ACSF), um alle auf der Gehirnoberfläche verbliebenen Ablagerungen zu entfernen und zu waschen. Wiederholen Sie diesen Reinigungsvorgang mehrmals, um Entzündungsreaktionen zu unterdrücken.HINWEIS: Die ACSF-Lösung (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 2,0 mM CaCl 2 und 1,0 mM MgCl2) wurde 1 Monat lang bei 4 °C gelagert, nachdem das Reagenz gelöst und filtriert wurde (Porengröße = 0,22 μm). Stellen Sie mit einem Druckinjektionssystem (siehe Materialtabelle) den entsprechenden Druck (ca. 10 PSI in Impulsen mit einer Dauer von 4 ms) ein, um 500 nL AAV-Lösung durch eine Glaskapillare mit einem Spitzendurchmesser von 10-20 μm (hergestellt mit einem Mikropipettenabzieher) für 10 min zu injizieren. Stellen Sie fest, ob die AAV-Lösung dem Gehirn verabreicht wird, indem Sie überprüfen, ob der Spiegel der AAV-Lösung in der Glaskapillare allmählich abnimmt. Lassen Sie die Glaskapillare weitere 10 Minuten an Ort und Stelle, um einen Rückfluss zu verhindern. Wiederholen Sie dies dreimal, um insgesamt 1,5 μl AAV-Lösung in das Gehirn zu verabreichen. Um die neuronale Aktivität in Pyramidenzellen der Schicht 2/3 (L2/3) zu untersuchen und zu manipulieren, wird eine AAV-Lösung (für Ca 2+-Bildgebung: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE bei 1,28 × 10 14 Vektorgenomen/ml, 1:1 in Kochsalzlösung verdünnt; für Ca2+-Bildgebung mit Optogenetik: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE bei 1,73 × 1014 Vektorgenomen/ml, 1:1 in Kochsalzlösung verdünnt) in den Hinterpfotenbereich des primären somatosensorischen Kortex von Wildtyp-Mäusen injiziert (S1, zentriert 0,5 mm posterior und 1,5 mm lateral von der Bregma, 150 μm Tiefe von der Oberfläche).HINWEIS: Die AAV-Lösung sollte 2-3 Wochen und 1-2 Wochen vor der Bildgebung für die Expression von jGCaMP8f bzw. GCaMP6m-P2A-ChRmine injiziert werden. Nach einer Applikation von 2 % (w/v) niedrigschmelzender Agarose auf die Hirnoberfläche von S1 mit einer Mikropipette wird ein Glasfenster mit zwei Deckgläsern über die Kraniotomie gelegt. Befestigen Sie die beiden Deckgläser (kleiner 2,0 mm Durchmesser und großer 4,5 mm Durchmesser; siehe Materialtabelle) mit UV-härtendem Kleber. Drücken Sie das Deckglas gegen die Agarose, solange sie noch flüssig ist; Dadurch wird die Bildung von Luftblasen in der Agarose verhindert. Versiegeln Sie die Ränder des Schädelfensters mit Dental- und Haftharzzement (Abbildung 1C). Entfernen Sie die Maus vom stereotaktischen Instrument und legen Sie sie in ihren Käfig zurück. Setzen Sie die Maus in einen warmen Käfig und kehren Sie nicht mit anderen Tieren in den Käfig zurück, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat. Halten Sie während der Überlebensoperation sorgfältig sterile Bedingungen aufrecht. Überprüfen Sie in den ersten 72 Stunden nach der Operation den Gesundheitszustand der Maus, indem Sie das allgemeine Verhalten beobachten. Wenn es Anomalien im allgemeinen Verhalten gibt, injizieren Sie subkutan entzündungshemmende und schmerzstillende Mittel. 3. Vorbereitung für das holographische Stimulations- oder Beleuchtungssystem (Abbildung 3) Kalibrieren Sie das holographische Stimulationssystem, indem Sie die Oberfläche eines roten Fluoreszenzobjektträgers (gegossenes Acrylsubstrat) auf der Probenebene platzieren. Versetzen Sie das Mikroskop in den Live-Bildgebungsmodus mit schwachem Anregungslicht und führen Sie calibration_GUI.m-Datei aus. Überprüfen Sie den Parameterbereich und klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern . Klicken Sie im Bereich Schritt 1 auf die Schaltfläche Z-Scan . Es generiert automatisch drei zufällige Punkte in allen 21 axialen Ebenen, die 2 μm von jeder Ebene entfernt sind. Verschieben Sie den Schieberegler und überprüfen Sie das Live-Bild. Suchen Sie eine perfekte Ebene, in der die Punkte am kleinsten und hellsten erscheinen, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Speichern . Dadurch wird automatisch eine versetzte sphärische Wellenfront für das digitale Hologramm erzeugt.HINWEIS: Wenn Sie die hellsten Fluoreszenzflecken nicht finden können, ändern Sie die Minimal- und Maximalwerte des Scanbereichs und versuchen Sie es erneut. Klicken Sie im Bereich Schritt 2 auf die Schaltfläche Los , und klicken Sie dann auf sechs Stellen auf dem linken Quadrat. Überprüfen Sie das Live-Bild. Wenn sechs unterscheidbare Fluoreszenzflecken vorhanden sind, geben Sie deren x- und y-Achse in die Bearbeitungsfelder ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern . Dadurch werden automatisch affine Transformationskoeffizienten generiert, um die Kalibrierung zwischen dem holografischen Stimulations- und dem Bildgebungssystem zu koordinieren.HINWEIS: Die Nummer des Achsenpaars und die Nummer des angeklickten Spots müssen in der richtigen Reihenfolge übereinstimmen. Wenn Sie sich nicht sicher sind oder wenn Ihr Bild keine Flecken enthält, versuchen Sie es bitte erneut und generieren Sie ein eindeutiges Punktmuster oder wählen Sie einen kleineren Bereich um die Mitte des Sichtfelds (FOV). Klicken Sie im Bereich Schritt 3 auf die Schaltfläche Scannen . Es wird 441 digitale Hologramme generieren, um in 21 × 21 Schritten Einzelpunktscans über das gesamte Sichtfeld durchzuführen.Überprüfen Sie zunächst die Bilder, während Sie die Muster im Listenfeld ändern. Passen Sie dann die Laserleistung an, um Spotbilder innerhalb des Dynamikbereichs des Bildgebungsgeräts zu erhalten (z. B. um übersättigte Bilder zu vermeiden). Passen Sie anschließend die Intervallzeit im Bearbeitungsfeld an. Die Intervallzeit sollte mehr als das Doppelte der Aufnahmeintervallzeit betragen. Versetzen Sie abschließend das Bildgebungsgerät in den Aufnahmemodus und klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe . Wenn die Wiedergabe beendet ist, werden im Befehlsfenster die Zeichenfolgen “OK anzeigen” angezeigt. Stoppen Sie die Aufnahme und stapeln Sie aufgezeichnete sequenzielle Bilder mit der Methode “Maximale Intensität”. Klicken Sie im Bereich Schritt 4 auf WM generieren und wählen Sie oben ein gestapeltes Bild aus. Schließen Sie dann das calibration_GUI Fenster. Es wird automatisch eine Gewichtskarte erstellt, um die unausgewogene Intensität an jeder Stelle auszugleichen.HINWEIS: Eine detailliertere Beschreibung finden Sie unter 2; Der Matlab-Code kann hier heruntergeladen werden (https://github.com/ZenKG/SLM_control). 4. Ca2+ Bildgebung mit einem Bildsensor mit holografischer Beleuchtung (Abbildung 4) Legen Sie die AAV-injizierte Maus mit einer Kopfplatte unter das Mikroskop (Abbildung 1D).HINWEIS: Während dieses Vorgangs wird die Maus im Wachzustand zurückgehalten, kann aber unangenehmen Reizen entkommen. Führen Sie eine Zwei-Photonen-Bildgebung (Punkt-Scanning-Modus) mit einem holografischen Mikroskop und einem modengekoppelten Ti:Saphir-Laser durch, der auf 920 nm mit einem 25-fach-Objektiv abgestimmt ist (siehe Materialtabelle). Schalten Sie die kommerzielle Bildbearbeitungssoftware ein (siehe Materialtabelle). Passen Sie im Live-Bildgebungsmodus die Spannung des Bilddetektors (siehe Materialtabelle) und die Leistung des Bildgebungslasers an, um die Helligkeit der Neuronen zu optimieren, die jGCaMP8f exprimieren. Nehmen Sie Bilder von den Neuronen auf, die dieses Protein exprimieren.HINWEIS: Die Intensität des bildgebenden Lasers (920 nm) beträgt 20-30 mW. Das Sichtfeld betrug 512 μm × 512 μm in einer Tiefe von 100-150 μm von der kortikalen Oberfläche. Um bestimmte Neuronen, die jGCaMP8f exprimieren, mit holografischer Beleuchtung zu beleuchten, führen Sie die Skriptdatei SLMcontrol.m aus. Klicken Sie auf das Referenzbild und wählen Sie das oben aufgenommene Bild aus. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Punkt, um durch kontinuierlichen Mausklick bestimmte Pixel auf den Neuronen im Bild auszuwählen (Abbildung 4A). Wenn die Auswahl abgeschlossen ist, drücken Sie die Eingabetaste auf der Tastatur, um sie abzuschließen.HINWEIS: Das digitale Hologramm wird automatisch berechnet und auf dem SLM angezeigt. Dieses Muster kann auch erneut aufgerufen werden, indem Sie auf ein Listenfeld klicken. Die räumliche Auflösung eines einzelnen Punkts, der durch die SLM erzeugt wurde, betrug etwa 1,2 μm entlang der transversalen Richtung und ~8,3 μm entlang der optischen Achse. Wir verwendeten ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur (1,1), um eine lokalere holographische Stimulation zu erreichen. Tabelle 1 fasst frühere Berichte und dieses System in Bezug auf die räumliche Auflösung der holographischen Stimulation zusammen. Um neuronale Aktivität mit hoher zeitlicher Auflösung mit einem Bildsensor zu erkennen (siehe Materialtabelle), stellen Sie die Belichtungszeit, den Bildbereich und das Binning (Abbildung 4B) ein, bevor Sie die Bildaufnahme durchführen (Abbildung 4C).HINWEIS: Die Intensität des holografischen Beleuchtungslasers (920 nm), der kontinuierlich ein Neuron stimuliert, beträgt 2 mW, was ausreicht, um die neuronale Aktivität zu erkennen. Um beispielsweise eine Bildrate von 100 Hz für die Bildgebung zu erreichen, beträgt die Belichtungszeit 9 ms, der Abbildungsbereich 400 μm × 400 μm und das Binning 4. Bringen Sie die Maus nach dem Experiment in ihren Heimatkäfig zurück. 5. Zwei-Photonen-Bildgebung (Point-Scanning-Modus) mit Optogenetik unter Verwendung eines holographischen Mikroskops (Abbildung 2) Wiederholen Sie die Schritte 4.1 und 4.2. Schalten Sie die kommerzielle Bildbearbeitungssoftware ein (siehe Materialtabelle). Passen Sie im Live-Bildgebungsmodus die Spannung des Bilddetektors (siehe Materialtabelle) und die Leistung des Bildgebungslasers an, um die Helligkeit der Neuronen zu optimieren, die GCaMP6m-P2A-ChRmine exprimieren. Nehmen Sie Bilder der Neuronen auf, die diese Proteine exprimieren (Abbildung 1E). Wiederholen Sie Schritt 4.4. Um die funktionelle Konnektivität innerhalb von L2/3-Neuronen zu untersuchen, verwenden Sie ein SLM, um holographische Muster optogenetischer Stimulation (ChRmine; 1.040 nm) zu erzeugen, und kombinieren Sie es mit Zwei-Photonen-Ca2+-Bildgebung (GCaMP6m;920 nm, 512 × 512 Pixel, 2 Hz oder 30 Hz, 2-facher Digitalzoom, Punkt-Scanning-Modus; Abbildung 4D-H).Stellen Sie für dieses Protokoll die Intensität des Bildgebungslasers auf 920 nm bei 10-20 mW und das Sichtfeld auf 256 μm × 256 μm ein, gemessen in einer Tiefe von 100-150 μm von der kortikalen Oberfläche. Stellen Sie die Pixelverweilzeit auf 1,5 μs für 2 Hz oder 100 ns für 30 Hz ein. Um zu sehen, ob ein einzelner holografischer Stimulus eine Kalziumreaktion in den Neuronen hervorgerufen hat, verwenden Sie sowohl 2 Hz als auch 30 Hz als Bildrate. Stellen Sie die Intensität des holografischen Stimulationslasers (1.040 nm) ein, der ein einzelnes Neuron mit 10 mW stimuliert, was ausreicht, um neuronale Aktivität zu induzieren (Abbildung 4D).HINWEIS: Die räumliche Auflösung eines einzelnen Punkts, der vom SLM erzeugt wird, beträgt ca. 1,2 μm entlang der Querrichtung und ~8,3 μm entlang der optischen Achse. Der Bereich des zugänglichen Volumens in lateraler Richtung beträgt ca. 500 μm × 500 μm und 100 μm in axialer Richtung. Wir haben außerdem mit Ca2+ Bildgebung bei 2 Hz oder 30 Hz Bildrate bestätigt, dass nicht nur ein Neuron, sondern mehrere Neuronen gleichzeitig holographisch stimuliert werden können (Abbildung 4E). Führen Sie die Bildaufnahme mit dem folgenden Protokoll durch: Simultane Abbildung der Ca2+ -Antwort bei 920 nm mit 10 holographischen Stimuli bei 1.040 nm mit Intervallen von 8 s (0,125 Hz) für eine Dauer von 50 ms nach einer Baseline-Periode von 10 s. Nachdem alle Experimente abgeschlossen sind, werden die Mäuse eingeschläfert.ANMERKUNG: Ca2+-Transienten, falls vorhanden, wurden durch holographische Stimulation hervorgerufen, wobei ihr Höhepunkt innerhalb von 1 s nach der Stimulation auftrat (Abbildung 4F-H). 6. Bildanalyse und Bewertung der funktionalen Konnektivität (Abbildung 4) Öffnen Sie die in den Schritten 4.5 oder 5.5 gespeicherten RAW-Bilder mit ImageJ. Um die Verschiebung der Brennebene zu kompensieren, verwenden Sie das ImageJ-Plug-In TurboReg.HINWEIS: Wenn die Korrektur mit TurboReg nicht ausreicht, wird empfohlen, CaImAn (http://github.com/simonsfoundation) zu verwenden, um die Verschiebung der Brennebene zu korrigieren. Um die neuronale Aktivität zu bewerten, bestimmen Sie die Regions of Interest (ROIs) in L2/3 mithilfe eines automatisierten Algorithmus (CaImAn). Detektion und Analyse von Ca2+ -Transienten nach Definition der Basis-Fluoreszenzintensität (F0) und des Schwellenwerts.HINWEIS: F0 ist der 35. Perzentilwert der Fluoreszenzintensität, der während der Bildgebungsphase zu Studienbeginn erfasst wurde. Ca2+-Transienten werden mit Δ F/F 0 (Δ F = F-F0) bezeichnet, wobei F das momentane Fluoreszenzsignal ist. Wenn der Δ F-Wert über 2 S.D. von F0 liegt, werten wir einen signifikantenCa2+-Transienten aus. Um die funktionelle Konnektivität in L2/3-Neuronen zu definieren, werden Zielneuronen stimuliert und die GCaMP6m-Antworten in stimulierten und umgebenden Neuronen entsprechend gemessen (Abbildung 4F-H).

Representative Results

Repräsentative Aufnahmen, die mit dem hier beschriebenen Verfahren gewonnen wurden, werden vorgestellt. Im lebenden Organismus Die Ca2+ -Bildgebung mittels holographischer Mikroskopie dauert 2-4 Wochen von der Implantation der Kopfplatte über die AAV-Injektion bis hin zur Datenerfassung. Um stabile Ergebnisse zu erhalten, ist es daher wichtig, Bewegungsartefakte im Gehirn zu reduzieren. Die Implantation der Kopfplatte (Schritt 1.5) und die Platzierung des Schädelfensters (Schritt 2.9) sind sehr wichtige Schritte in diesem Prozess. Darüber hinaus ist es auch wichtig, ein AAV (AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1) auszuwählen, das gleichzeitig Calciumindikator und Opsin in einem einzigen Neuron exprimiert (Schritt 2.8). Abbildung 4A zeigt einen Spot für die holographische Beleuchtung eines aufgenommenen Neuronenbildes unter Verwendung eines benutzerdefinierten MATLAB-Skripts. Wenn die holographische Beleuchtung die Neuronen, die jGCaMP8f exprimieren, erfolgreich beleuchtet, können mit einem Bildsensor Ca2+-Spuren erhalten werden (Abbildung 4B), wie in Abbildung 4C gezeigt. Die funktionelle Konnektivität zwischen Neuronen wurde mittels holographischer Stimulation (Abbildung 4D) evaluiert, wie in Abbildung 4E dargestellt. Da die funktionelle Konnektivität zwischen Neuronen eine der Eigenschaften der neuronalen Schaltkreise ist, die in der Pathogenese einer Schmerzmodellmaus24 verändert ist, beschreiben wir ein einfaches Verfahren, um sie zu bewerten. Abbildung 4F zeigt ein typisches Bild von L2/3-Neuronen in S1HL, das mit GCaMP6m visualisiert wurde. Wenn ein Neuron (oranger Kreis) holographisch stimuliert wurde, war gleichzeitig ein anderes Neuron (roter Kreis) aktiv; Somit war die Anzahl der funktionellen Verbindungen zwischen Neuronen eins (Abbildung 4G). Abbildung 1: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs . (A) Fixierung der Kopfplatte am Schädel. (B) Stereotaktische Injektion von AAV in den Hinterpfotenbereich des primären somatosensorischen Kortex (S1HL). (C) Implantation des kranialen Fensters. Um die neuronale Aktivität zu beurteilen und zu manipulieren, wird in vivo Ca2+ Bildgebung an wachen Mäusen (D) mit holographischer Stimulation (E) durchgeführt. Blitzmarkierungen weisen auf holographische Stimulation oder Beleuchtung hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: System für das holographische Mikroskop. (A) Aufnahmen der holographischen Stimulations- und Beleuchtungsstrahlengänge (links) in der Nähe des Mikroskops (Mitte) mit einem Bildsensor (rechts). (B) Dabei handelt es sich um vergrößerte Bilder von holographischen Stimulations- und Beleuchtungslichtpfaden um die jeweiligen SLMs (links und rechts) und einem Punkt-Scanning-Lichtpfad um einen Scankopf (Mitte und rechts). (C) Eine schematische Darstellung der optischen Pfade der Stimulation und der Abbildung. Zur Darstellung digitaler Hologramme werden reine Phasen-SLMs verwendet, und ein Beam Expander (eine Kombination aus L1 und L2) und ein 4f-Relaissystem (eine Kombination aus L3 und L4 für die holographische Stimulation und L4 und L5 für die holografische Beleuchtung) werden vor und nach den jeweiligen SLMs platziert, um sicherzustellen, dass jedes digitale Hologramm an der Austrittspupille einer Wasserimmersionsobjektivlinse abgebildet wird. mit leicht unterfüllter Bildgröße. Um Restkomponenten nullter Ordnung zu unterdrücken, wird ein Balkenblock in der Zwischenebene platziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Flussdiagramm zur Kalibrierung des holographischen Stimulations- oder Beleuchtungssystems. Dieses Flussdiagramm beschreibt die Schritte zur Kalibrierung eines holografischen Stimulations- oder Beleuchtungssystems auf den Probenraum und das Bildgebungssystem. Bitte besuchen Sie Schritt 3, Vorbereitung für das holographische Stimulations- oder Beleuchtungssystem, für detaillierte Anweisungen und laden Sie ein Beispielprogramm herunter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse der Bildgebung und funktionellen Konnektivität unter Verwendung eines holographischen Mikroskops . (A) Um bestimmte Neuronen zu beleuchten, die jGCaMP8f oder GCaMP6m-P2A-ChRmine exprimieren, wird das Bild von Neuronen aufgenommen und dann mit Hilfe eines benutzerdefinierten MATLAB-Skripts ein Punkt auf dem Neuron gebildet. (B) Die Einstellung des Bildsensors (Belichtungszeit, Bildbereich und Binning). (C) Repräsentatives Bild und Spuren von Neuronen, die jGCaMP8f exprimieren, in 100-Hz-Bildgebung mit holographischer Beleuchtung und einem Bildsensor. (D) Diese Grafik zeigt die neuronale Reaktion auf holographische Stimulation (1.040 nm) bei jeder Laserleistung (Daten von GCaMP6m-P2A-ChRmine, die Neuronen mit einer Bildrate von 2 Hz exprimieren [n = 16]). Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts an. (E) Repräsentative Ca2+ Spuren während der holographischen Stimulation (blaue vertikale Linien) von 10 verschiedenen Neuronen bei 2 Hz (links) und 30 Hz (rechts) Bildraten. In 2 Hz und 30 Hz Ca2+ Spuren zeigt die gleiche Farbe das gleiche Neuron an. (F) Schematische Darstellung der funktionellen Verbindungen zwischen Neuronen. Wenn das orangefarbene Neuron stimuliert wird, reagieren die roten Neuronen gleichzeitig, was darauf hinweist, dass eine funktionelle Verbindung zwischen diesen Neuronen besteht. (G) Ein typisches Bild von S1HL-Neuronen, die GCaMP6m in WT exprimieren. Maßstabsbalken = 10 μm. (H) Typische Ca2+ -Spuren während der holographischen Stimulation (blaue vertikale Linien) bei Bildraten von 2 Hz (oben) und 30 Hz (unten). Das stimulierte Neuron ist orange eingekreist, die antwortenden Neuronen sind rot eingekreist und die nicht reagierenden Neuronen sind grau eingekreist. Die neuronale Reaktionsfähigkeit auf holographische Stimulation kann sowohl bei 2-Hz- als auch bei 30-Hz-Bildgebungsgeschwindigkeiten nachgewiesen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Unser Set-up 6  Prakash, R. et al. 25  Marshel, J. H. et al. 12 Robinson, N. T. M. et al. 14 Laterale Auflösung 1,2 μm 1,27 μm ― 2,22 μm Axiale Auflösung 8,3 μm 56,86 μm 15,5 μm 10,26 μm Objektiv/Numerische Apertur 25x/1,1 20x/0,5 16x/0,8 16x/0,8 Tabelle 1: Zusammenfassung früherer Berichte und dieses Systems zur räumlichen Auflösung holographischer Stimulation. Die laterale Auflösung, die axiale Auflösung und die bei der Messung verwendete Objektivlinse werden beschrieben.

Discussion

Um die Gehirnfunktion zu verstehen, ist es notwendig, die neuronalen Schaltkreise, die der Gehirnfunktion zugrunde liegen, genau zu beurteilen, indem die Dynamik der neuronalen Aktivität extrahiert wird. Darüber hinaus ist es wichtig zu identifizieren, wie diese neuronalen Schaltkreise verändert werden, um die Pathogenese neuropsychiatrischer Erkrankungen aufzuklären. Tatsächlich ist bekannt, dass die neuronale Aktivität in Mausmodellen der Alzheimer-Krankheit4 und des Fragilen X-Syndroms26 sowie in Mäusen mit eingeschränkter Funktion der weißen Substanz3 erhöht ist. Darüber hinaus ist in einem Mausmodell für entzündliche Schmerzen eine erhöhte Synchronisation der neuronalen Aktivität und der funktionellen Konnektivität zwischen Neuronen mit Symptomen assoziiert24. Die holographische Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht es uns, gleichzeitig die Aktivität einzelner Neuronen und die funktionellen Verbindungen zwischen Neuronen zu beobachten, was für das Verständnis neuronaler Schaltkreise notwendig ist. Wir verwendeten ein 25-faches Objektiv mit numerischer Apertur = 1,1 und Wellenlängen von 1.040 nm. Die theoretische Punktspreizfunktion ist eine Gaußsche Verteilung mit voller Breite bei halbem Maximum von 0,5 μm lateral und 1,7 μm axial. Die tatsächliche numerische Apertur beträgt jedoch weniger als 1,1, und die gemessene Punktgröße auf einer Fluoreszenzperle beträgt 1,2 μm lateral und 8,3 μm axial. Angesichts der Tatsache, dass der Neuronendurchmesser etwa 15 μm beträgt und der Kalibrierungsfehler innerhalb von 3 μm liegt, ist das Targeting im Allgemeinen gut. Zellen in axialer Richtung können jedoch durch die längere Spotgröße6 beeinträchtigt werden. Hier haben wir die virale Injektion, die Operation, die Kalibrierung von holographischen Stimulations- oder Beleuchtungssystemen und Bildgebungsprotokolle zur Bewertung und Manipulation der neuronalen Aktivität in lebenden Mäusen mit unserem Mikroskopiesystem beschrieben.

Es dauert 2-4 Wochen, um alle experimentellen Verfahren abzuschließen, von der Implantation der Kopfplatte über die Virusinjektion bis hin zur Datenerfassung für die In-vivo-Ca2+-Bildgebung mittels holographischer Mikroskopie. Der Prozess ist komplex und mühsam, und der letztendliche Erfolg des Experiments hängt von mehreren Faktoren ab, darunter der Zustand des Schädelfensters, das von einer postoperativen Entzündung betroffen ist, die richtige Wahl des Ca2+-Indikators und des Opsins und ob Bewegungsartefakte in den aufgenommenen Bildern korrigiert werden können. Wichtig für ein erfolgreiches Ergebnis sind insbesondere zwei Schritte. Die erste betrifft die Fixierung der Kopfplatte und die Operation; Entscheidend ist, dass die Kopfplatte mit Zahnzement fest am Mäusekopf befestigt wird. Darüber hinaus ist es wichtig, Knochenfragmente und geronnenes Blut während der Operation wiederholt mit kaltem ACSF zu reinigen. Da die Einhaltung dieses Verfahrens die Entzündung reduziert, ist es uns gelungen, die Dynamik der Mikroglia, der Zellen, die für das Immunsystem des Gehirns verantwortlich sind, zu beobachten, ohne ihre Fortsätze und Stacheln oder die Mikrostrukturen von Neuronen zu aktivieren27,28. Das zweite Problem ist die Bewertung und Manipulation der neuronalen Aktivität. Wir wählten AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1, um den Ca2+ Indikator und das Opsin gleichzeitig in einem Neuron zu exprimieren. Dies liegt daran, dass es schwierig ist, ein Neuron effizient mit verschiedenen AAV-Typen zu infizieren. Ein weiterer Grund für diese Wahl war, dass ChRmine die neuronale Aktivität bei 1.040 nm mit einem Zwei-Photonen-Laser effizient aktivieren kann12. Kürzlich wurde berichtet, dass ChRmine durch die Mutation seiner Struktur auf der Grundlage von Strukturinformationen, die durch Kryo-Elektronenmikroskopie gewonnen wurden, seine Funktion29 verbessert, was für die Analyse der Zielfunktionen im Bereich der Neurowissenschaften als nützlich angesehen wird. Vor diesem Hintergrund ist es notwendig, effektive Methoden zur Bewertung und Manipulation von Neuronen beim Lesen neuronaler Aktivität und beim Schreiben von Informationen mithilfe der holographischen Mikroskopie zu teilen.

Jüngste Fortschritte in der Bildgebung und Optogenetik haben die detaillierte neuronale Aktivität aufgedeckt, die an Gehirnfunktionen wie Lernen und Gedächtnis beteiligt ist, und es ist möglich, diese neuronale Aktivität künstlich zu manipulieren, um Gehirnfunktionen auszudrücken30. Herkömmliche Methoden zur Manipulation der neuronalen Aktivität sind jedoch hochinvasiv, da optische Fasern in das Gehirn eingeführt werden und gleichzeitig eine Gruppe von Opsin-exprimierenden Zellen stimuliert wird, was es unmöglich macht, die neuronale Aktivität mit zeitlicher und räumlicher Präzision zu manipulieren. Unsere Methode kann die neuronale Aktivität manipulieren, indem sie nur bestimmte Neuronen im Gehirn stimuliert, was eine Manipulation der neuronalen Aktivität mit spezifischen Stimulationsmustern und hoher raumzeitlicher Auflösung ermöglicht. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass die funktionelle Konnektivität zwischen Neuronen nur in einer kleinen Anzahl von Neuronen mit Hilfe von Brain-Slice-Experimenten bewertet werden kann31; Diese Technik ermöglicht jedoch die gleichzeitige Auswertung mehrerer Neuronen in lebenden Tieren.

Eine der größten Einschränkungen aktueller holografischer Mikroskope ist die Notwendigkeit, den Mauskopf zu fixieren, was das Verhalten der Maus einschränkt. Vor kurzem wurde ein miniaturisiertes Zwei-Photonen-Mikroskop32 entwickelt, und mit der weiteren Miniaturisierung des Geräts könnte eine In-vivo-Ca2+-Bildgebung mit holographischer Stimulation bei frei beweglichen Mäusen möglich sein. Darüber hinaus könnte das Potenzial dieses Mikroskops erweitert werden, indem die zeitliche Auflösung der Bildgebung verbessert und mit hochempfindlichen spannungsempfindlichen fluoreszierenden Proteinen kombiniert wird33.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grants-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (19H04753, 19H05219 und 25110732 an H. W.), Grants-in-Aid for Transformative Research Areas (A) (20H05899 an H. W., 20H05886 an O. M. und 21H05587 an D. K.), Fostering Joint International Research (B) (20KK0170 an H. W.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (18H02598 an H. W.), Grant-in-Aid for Scientific Research (A) (21H04663 an O. M.), Grant-in-Aid for Early-Career Scientists (20K15193 to X. Q.), JST CREST Grant-Nummer JPMJCR1755, Japan, und JST A-STEP Grant-Nummer JPMJTR204C.

Materials

25x Objective Nikon N25X-APO-MP Objective
A1MP Nikon A1MP Microscope
AnesII Bio machinery AnesII Anesthesia delivery system
C2 plus Nikon C2 plus Microscope
DECADRON Phosphate Injection Aspen 21N024 Avoid cerebral edema
Dental Drill Jota C1.HP.005 Dental drill
Electric Microinjector NARISHIGE IM-31 Pressure injection system
FEATHERS FEARGER FA-10 Shaving
G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER GC 2110271 Resin cement primer for dental adhesion
G-CEM ONE neo GC 43093 Resin cement for dental adhesion
Glass Capillary with Filament NARISHIGE GDC-1 Glass capillary
Image Detector Hamamatsu H10770PA-40 GaAsP photocathode photomultiplier tube
Imaging Software Nikon NISelements Imaging software
Isoflurane Inhalation Solution Pfizer 229KAR Anesthetics
iXon EMCCD Camera Andor iXon Life 888 Image sensor
Ketamine daiitisannkyou s9-018506 Anesthetics
Leica-M60 Leica M60 Stereoscope
Linicon Linicon LV-125 Vacuum pump
Mode-locked Ti:sapphire Chameleon Ultra II laser  Coherent Chameleon Discovery NX Femtosecond laser
Mos-Cure U-VIX mini 365 Portable LED UV Light Source
PEN Bright SHOFU INC. PEN Bright Dental light curing unit
Puller SUTTER instaument P-97 Puller
Stereotaxic Instrument (for Mice) NARISHIGE SR-6M-H Stereotaxic instrument
Stereotaxic Micromanipulator NARISHIGE SM-15R Stereotaxic micromanipulator
Super-Bond CATALYST V SUN MEDICAL 8070 Dental adhesive resin cement
Super-Bond Dental Adhesive Monomer SUN MEDICAL 8071 Dental adhesive monomer
Super-Bond Teeth Color Polymer Powder SUN MEDICAL 145052000 Teeth color polymer powder
Tarivid Ophthalmic Ointment 0.3% Santen Pharmaceutical  TRN3952 Eye ointment
UlTIMATE XL NSK Y141446 Dental laboratory micromotor control unit
UV Curing Optical Adhesives THORLABS NOA61 UV Curing Optical Adhesives
Xylazine Bayer KP0F2BK Anesthetics
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Kato, D., Quan, X., Tanisumi, Y., Guo, Z., Morita, M., Takiguchi, T., Matoba, O., Wake, H. Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy. J. Vis. Exp. (187), e64205, doi:10.3791/64205 (2022).
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