Kranievinduer er blevet en allestedsnærværende implementeret kirurgisk teknik for at muliggøre intravital billeddannelse hos transgene mus. Denne protokol beskriver brugen af en kirurgisk robot, der udfører halvautomatisk knogleboring af kranievinduer og kan hjælpe med at reducere kirurg-til-kirurg-variabilitet og delvist afbøde termisk blod-hjerne-barriereskade.
Kranial vindueskirurgi giver mulighed for billeddannelse af hjernevæv i levende mus ved brug af multifoton eller andre intravitale billeddannelsesteknikker. Men når man udfører kraniotomi i hånden, er der ofte termisk skade på hjernevæv, som i sagens natur er variabel kirurgi til kirurgi og kan være afhængig af individuel kirurgteknik. Implementering af en kirurgisk robot kan standardisere kirurgi og føre til et fald i termisk skade forbundet med kirurgi. I denne undersøgelse blev tre metoder til robotboring testet for at evaluere termisk skade: vandret, punkt for punkt og pulserende punkt for punkt. Vandret boring bruger et kontinuerligt boreskema, mens punkt-for-punkt borer flere huller, der omfatter kranievinduet. Pulserende punkt-for-punkt tilføjer et “2 s on, 2 s off” boreskema for at muliggøre afkøling mellem boringen. Fluorescerende billeddannelse af Evans Blue (EB) farvestof injiceret intravenøst måler skade på hjernevæv, mens et termoelement placeret under borestedet måler termisk skade. Termoelementresultater indikerer et signifikant fald i temperaturændringen i de pulserende punkt-for-punkt (6,90 °C ± 1,35 °C) grupper sammenlignet med de vandrette (16,66 °C ± 2,08 °C) og punkt-for-punkt (18,69 °C ± 1,75 °C) grupper. På samme måde viste den pulserende punkt-for-punkt-gruppe også signifikant mindre EB-tilstedeværelse efter kranial vinduesboring sammenlignet med den vandrette metode, hvilket indikerer mindre skade på blodkar i hjernen. Således synes en pulserende punkt-for-punkt boremetode at være den optimale ordning til reduktion af termisk skade. En robotboremaskine er et nyttigt værktøj til at minimere træning, variabilitet og reducere termiske skader. Med den voksende brug af multifotonbilleddannelse på tværs af forskningslaboratorier er det vigtigt at forbedre resultaternes stringens og reproducerbarhed. De metoder, der behandles her, vil hjælpe med at informere andre om, hvordan man bedre kan bruge disse kirurgiske robotter til yderligere at fremme feltet.
Kranievinduer er blevet allestedsnærværende brugt inden for neurovidenskab, neural teknik og biologi for at muliggøre direkte visualisering og billeddannelse af cortex hos levende dyr 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Den kraftfulde kombination af transgene mus og multifotonbilleddannelse har givet ekstremt værdifuld indsigt i kredsløbsaktivitet og anden biologisk indsigt i in vivo-hjernen 12,13,14,15,16,17,18. Miniaturemikroskoper monteret på kraniet har yderligere udvidet disse muligheder for at muliggøre optagelser i vågne, frit bevægelige dyr19. Processen med at skabe et kranievindue kræver powerboring for at tynde eller helt fjerne kraniebenet for at producere store nok kraniotomier til at sikre et gennemsigtigt stykke glas over cortex20. Polydimethylsiloxan (PDMS) og andre polymerer er også blevet testet som kranievinduesmaterialer 9,21. I sidste ende er det ideelle kranievindue et, der ikke ændrer eller forstyrrer normal endogen aktivitet nedenunder. Det er imidlertid almindeligt accepteret, at kranial vinduesboring forværrer underliggende væv, hvilket fører til skade på hjernen, forstyrrelse af miljøet og påvirker meninges til det punkt, hvor multifotonbilleddannelse falder22. Den resulterende neuroinflammation har en bred vifte af virkninger, der spænder fra permeabilitet af blod-hjerne-barrieren (BBB) til aktivering og rekruttering af gliaceller omkring implantatstedet23. Derfor er karakterisering af sikrere og mere reproducerbare kranievinduesboremetoder afgørende for ensartet billedkvalitet og reduktion af forstyrrende faktorer.
Mens man sørger for at minimere traumer i det underliggende væv, har handlingen med at bore knoglen potentialet til at forårsage både termiske og mekaniske forstyrrelser i hjernen24,25. Mekanisk traume fra utilsigtet borindtrængning i dura kan yderligere fremkalde varierende grader af kortikal skade24. I en undersøgelse af Shoffstall et al.25 resulterede varmen fra knogleboring i en øget BBB-permeabilitet, som indikeret af tilstedeværelsen af Evans Blue (EB) farvestof i hjernens parenchyma25. EB-farvestof, injiceret intravenøst, binder sig til cirkulerende albumin i blodbanen og krydser derfor normalt ikke en sund BBB i mærkbare koncentrationer. Som et resultat anvendes EB-farvestof almindeligvis som en følsom markør for BBB-permeabilitet26,27. Mens deres undersøgelse ikke direkte målte virkningen af BBB-permeabiliteten på efterfølgende biologiske følgevirkninger, der blev undersøgt, har tidligere undersøgelser korreleret BBB-permeabilitet med et øget neuroinflammatorisk respons på kronisk implanterede mikroelektroder og ændringer i motorisk funktion28.
Afhængigt af undersøgelsens mål kan størrelsen af termisk og mekanisk skade bidrage til en kilde til eksperimentel fejl, hvilket negativt påvirker undersøgelsens strenghed og reproducerbarhed. Der er snesevis af citerede metoder til fremstilling af kranievinduer, hver ved hjælp af forskellige boreudstyr, hastigheder, teknikker og brugere 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 rapporterede, at den observerede variation i opvarmningsresultaterne blev tilskrevet variabilitet i borets påførte kraft, tilførselshastighed og anvendelsesvinkel, blandt andre aspekter, der ikke kan kontrolleres for ved boring medhånden 25. Der er en tro på, at automatiserede boresystemer og andet stereotaksisk udstyr kan forbedre reproducerbarheden og udfaldskonsistensen, men offentliggjorte metodestudier har ikke nøje evalueret temperatur eller BBB-permeabilitet som et af resultaterne. Derfor er der behov for mere reproducerbare og konsekvent anvendte metoder til fremstilling af kranievinduer samt metoder, der anvendes strengt til at vurdere virkningen af kranievinduesboring på underliggende neuralt væv.
Fokus for denne undersøgelse er at bestemme og udvikle konsistente og sikre boremetoder til kranievinduer. Størrelsen af kraniotomien til kranial vinduesinstallation er signifikant større end standard kraniotomier til hjerneimplanterede mikroelektroder. Sådanne kraniotomier kan ikke udfyldes med et enkelt burrhul, når der anvendes standardudstyr, hvorved der indføres mere interkirurgisk teknikvariation, når den udføres med hånd20. Kirurgiske borerobotter er blevet introduceret til feltet, men er ikke blevet bredt vedtaget 1,6,29. Automatisering af boring giver kontrol over variabler, der bidrager til observeret variation fra forsøg til forsøg, hvilket tyder på, at brugen af udstyret kan reducere inter- og intrakirurgeffekter. Dette er af særlig interesse i betragtning af den ekstra vanskelighed ved den større kraniotomi, der er nødvendig for kranial vinduesplacering. Mens man kunne antage, at der var klare fordele ved den kontrol, der leveres ved automatisering af boringen, har der været ringe vurdering af implementeringen af dette udstyr. Selvom der ikke er observeret synlige læsioner5, ønskes den højere følsomhedstest med EB.
Her måles BBB-permeabilitet ved hjælp af en kommercielt tilgængelig kirurgisk borerobot med tilsvarende software, som giver mulighed for programmering af stereotaksiske koordinater, kraniotomiplanlægning/kortlægning og et udvalg af borestilarter (“punkt-for-punkt” vs “vandret”), der henviser til borets rutebane. Indledningsvis bores otte “frø” -punkter (figur 1A), der skitserer kranievinduet. Herfra skæres mellemrummet mellem frøene ud ved hjælp af enten “punkt-for-punkt” eller “vandret” boremetode. “Point-by-point” udfører lodrette pilothulskæringer (svarende til en CNC-borepresse), mens “vandret” udfører vandrette snit langs omkredsen af kranievinduet, der skitserer hullet (svarende til en CNC-router). Resultatet for begge metoder er et stykke kranium, der kan fjernes for at afsløre kranievinduet. For at isolere skader fra boring fjernes kranievinduet ikke fysisk for at undgå yderligere skader. En kombination af EB-farvestof kombineret med fluorescerende billeddannelse bruges til at måle BBB-permeabilitet efter udførelse af kraniotomier hos mus, og et indsat termoelement bruges til direkte at måle temperaturen på hjerneoverfladen under boring (figur 1B, C). Tidligere observationer indikerede, at pulserende boring til/fra med 2 s intervaller var tilstrækkelig til at afbøde boreopvarmning25 og derfor er indarbejdet i den eksperimentelle tilgang til den kirurgiske robot.
Formålet med det præsenterede arbejde er at demonstrere metoder til vurdering af termiske skader fra kraniotomiboring. Mens metoderne præsenteres i forbindelse med automatiseret boring, kan sådanne metoder også anvendes på manuelle boreordninger. Disse metoder kan anvendes til at validere brugen af udstyr og/eller boresystemer, inden de vedtages som standardprocedure.
Figur 1: Skematisk eksperimentel pipeline. Skematisk demonstration af den proces, dyrene gennemgik til EB-kvantificering efter kraniel vinduesprocedure. (A) Skematisk opsætning af musen med stereotaksisk ramme og kirurgisk robotbor. Et eksempel kranievindue er vist over motorcortex med frøpunkter (grøn) og kantpunkter (blå). (B) Perfusionsopsætningen omfatter injektion af 1x fosfatbufret saltvand (PBS) i hele dyret for at fjerne blod efterfulgt af ekstraktion af hjernen. (C) Hjernen sættes derefter ind i EB-fluorescerende billeddannelsessystemkammer for at udføre fluorescerende billeddannelse på Evans Blue-farvestoffet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Brugen af EB-farvestof og billeddannelse er ligetil, hurtig og nyttig til evaluering af vaskulær skade i hjernen til nye metoder og teknikker. Uanset om du bruger en kirurgisk robot eller bekræfter metoder, der i øjeblikket udføres i laboratoriet, er det vigtigt at validere kirurgiske metoder for at isolere virkningerne af eksperimentelle behandlinger vs. kirurgisk indvirkning og forbedre dyrevelfærden. En termoelementopsætning er også nyttig til evaluering af boremetoder for at sikre, at der ikke sker opvarmning….
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev delvist støttet af Merit Review Awards GRANT12418820 (Capadona) og GRANTI01RX003420 (Shoffstall / Capadona) og Research Career Scientist Award # GRANT12635707 (Capadona) fra USA Department of Veterans Affairs Rehabilitation Research and Development Service. Derudover blev dette arbejde også delvist støttet af National Institute of Health, National Institute of Neurological Disorders and Stroke GRANT12635723 (Capadona) og National Institute for Biomedical Imaging and Bioengineering, T32EB004314, (Capadona / Kirsch). Dette materiale er baseret på arbejde støttet af National Science Foundation Graduate Research Fellowship under bevilling nr. GRANT12635723. Enhver mening, resultater og konklusioner eller anbefalinger, der udtrykkes i dette materiale, er forfatternes (e) og afspejler ikke nødvendigvis National Science Foundation’s synspunkter.
1x Phosphate Buffered Saline Type: Reagent |
VWR | MRGF-6235 | For Evans Blue dilution |
Aura Software Type: Tool |
Spectral Instruments Imaging | Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems | |
Buprenorphine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) Type: Tool |
Stoelting | 58640-1 | |
Carprofen Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
Cefazolin Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
Evans Blue Dye Type: Reagent |
Millipore Sigma | E2129 | Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline |
Isoflurane Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
IVIS Lumina II Type: Tool |
Perkin Elmer | CLS136334 | IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market |
Jenco Linearizing Thermometer Type: Tool |
Jenco | 765JF | For Thermocouple setup |
Ketamine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
LivingImage Type: Tool |
Perkin Elmer | Software for IVIS Lumina III | |
Marcaine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
Neurostar Software Type: Tool |
Stoelting | Comes with surgical robot purchase | |
Physiosuite with MouseSTAT® Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor Type: Tool |
Kent Scientific | PS-03 | Used to monitor vitals |
PrismPlus mice Type: Animal |
Jackson Labortory | 031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old | Animals used for the study |
Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments Type: Tool |
Stoelting | 58640 | Main robotic drill with stereotaxic frame |
Thermocouple Type: Tool |
TC Direct | 206-557 | For Thermocouple setup |
USB-6008 Multifunction I/O DAQ Type: Tool |
National Instruments | USB-6008 | For Thermocouple setup |
Xylazine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility |