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Summary
Abstract
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Protocol
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Immunologie und Infektion

Borreliella (Borrelia) burgdorferi의 필수 성분 In Vitro Transcription Assays

Published: July 22, 2022
doi:
10.3791/64134
, ,
1School of Medicine,Creighton University

Summary

시험관 내 전사 분석은 Borreliella burgdorferi의 전사 조절 메커니즘을 해독할 수 있습니다. 이 프로토콜은 B. burgdorferi RNA 중합효소를 정제하고 시험관 내 전사 반응을 수행하는 단계를 설명합니다. 시험관 전사 분석을 사용하는 실험적 접근법은 활성 RNA 중합효소의 신뢰할 수 있는 정제 및 보관을 필요로 합니다.

Abstract

Borreliella burgdorferi 는 대사 및 게놈 레퍼토리가 제한된 박테리아 병원체입니다. B. burgdorferi 는 척추동물과 진드기 사이를 세포 외로 이동하며 감염 시 이질적인 환경에서 생존하기 위해 전사 프로필을 극적으로 개조합니다. B. burgdorferi 연구의 초점은 박테리아가 전사 변화를 통해 환경에 어떻게 반응하는지 명확하게 이해하는 것입니다. 시험관 내 전사 분석을 통해 전사 조절의 기본 메커니즘을 생화학적으로 해부할 수 있습니다. 여기에서 우리는 B. burgdorferi RNA 중합효소 정제 및 저장, 시그마 인자 정제, DNA 템플릿 생성 및 시험관 내 전사 분석을 설명하는 자세한 프로토콜을 제시합니다. 상기 프로토콜은 B. burgdorferi 5A4 RpoC-His(5A4-RpoC)로부터 정제된 RNA 중합효소의 사용을 설명한다. 5A4-RpoC는 RNA 중합효소의 가장 큰 서브유닛을 코딩하는 rpoC 유전자에 10XHis-태그를 보유하는 이전에 발표된 균주입니다. 시험관내 전사 분석은 균주 5A4-RpoC로부터 정제된 RNA 중합효소, 하우스키핑 시그마 인자 RpoD의 재조합 버전 및 PCR 생성 이중 가닥 DNA 템플릿으로 구성됩니다. 체외 전사 분석을 조립하기 위한 단백질 정제 기술 및 접근 방식은 개념적으로 잘 알려져 있고 비교적 일반적이지만, RNA 중합효소에 대한 취급 고려 사항은 종종 유기체마다 다릅니다. 여기에 제시된 프로토콜은 B. burgdorferi RNA 중합효소에 대한 효소 연구를 위해 설계되었습니다. 상기 방법은 RNA 중합효소의 활성에 대한 전사 인자, 프로모터 및 번역후 변형의 역할을 시험하기 위해 적응될 수 있다.

Introduction

라임병과 재발열은 Borrelia 및 Borreliella 속의 스피로헤타 병원 균에 의해 발생합니다 1,2,3. 라임병은 북미에서 두드러진 매개체 매개 질병이며, 결과적으로 Borreliella burgdorferi는 스피로헤타 생물학을 연구하는 저명한 모델 유기체입니다 4,5. 전사 조절의 B. burgdorferi 메커니즘에 대한 조사는 진드기 벡터와 포유류 숙주 사이를 순환할 때 환경 변화에 대한 적응을 더 잘 이해하는 것을 목표로 합니다 6,7. pH, 온도, 삼투압, 영양소 가용성, 단쇄 지방산, 유기산, 용존 산소 및 이산화탄소 수준의 변화는 B. burgdorferi가 절지동물 벡터에서 생존하고 동물을 감염시키는 데 중요한 유전자의 발현을 조절합니다 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. 자극에 대한 이러한 반응을 조절 메커니즘과 연결하는 것은 B. burgdorferi 연구19의 중요한 측면이었습니다.

전사 인자와 시그마 인자는 세포 과정을 수행하는 유전자의 전사를 조절합니다. 라임과 재발열 스피로헤타에는 비교적 희박한 전사 인자와 대체 시그마 인자 세트가 있습니다. 그럼에도 불구하고 B. burgdorferi가 환경에 대한 반응을 지시하는 복잡한 전사 변화가 있습니다20,21,22. 환경 변화에 대한 반응으로 B. burgdorferi의 전사 변화를 유도하는 구체적인 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 시험관 내 전사 분석은 전사 인자 및 시그마 인자23,24,25,26의 기능 및 조절 메커니즘을 분석하기 위해 생화학적 접근법을 사용하기 위한 강력한 도구입니다.

B. burgdorferi RNA 중합효소를 이용한 시험관 전사 분석 시스템이 최근에 확립되었다24. 박테리아는 종종 독특한 세포 생리학을 가지고 있기 때문에 다른 종과 속의 RNA 중합효소는 효소 정제, 효소 저장 및 반응 완충 조건에 다르게 반응합니다27. B. burgdorferi는 또한 RNA 중합효소가 연구된 많은 박테리아 종과 유전적으로 거리가 멀다20. 용해, 세척 및 용출 완충액 조건, 저장 완충액, 시험관내 전사 반응 완충액 및 분석 구축 방법과 같은 효소 준비의 측면은 모두 RNA 중합효소 활성을 변경할 수 있습니다. 여기에서 우리는 RNA 중합효소 및 시그마 인자 RpoD의 정제, 선형 이중 가닥 DNA 템플릿의 생산 및 이 시스템을 사용하는 실험실 간의 재현성을 용이하게 하기 위한 시험관 내 전사 분석의 구축을 위한 프로토콜을 제공합니다. RpoD 의존적 전사의 선형 범위를 보여주기 위한 반응의 예를 자세히 설명하고 이 접근 방식의 한계와 대안에 대해 논의합니다.

Protocol

1. RNA 중합효소의 정제 및 RNA 중합효소 스톡의 제조 미세호기성 환경(34°C, 5% CO 2, 3% O 2)에서 BSKII 배지에서 배양된 B. burgdorferi RpoC-His10X의 2-4L에서 이전에 설명한 세포 수집 프로토콜28,29를 사용하여2-4 x 107 cells/mL의 밀도로 세포 펠릿을 수집합니다. 500mL 원심분리 병에서 4°C에서 10,000 x g에서 30분 ?…

Representative Results

반응의 제한 단계가 시그마 인자-매개 전사 개시인 시험관내 전사 반응에서, 전사 활성은 시그마 인자의 양에 따라 선형적으로 증가해야 한다. 우리는 RNA 산물에 방사성 표지 된 뉴클레오티드 결합의 결과적인 다양한 신호를 관찰하기 위해 두 가지 농도의 RNA 중합 효소와 함께 다양한 RpoD 농도를 테스트하는 시험관 내 전사 실험의 준비를 제시합니다. RNA 중합효소, RpoD, 및 이중-가닥 D…

Discussion

제시된 프로토콜을 사용하여 구성된 시험관 내 전사 분석은 최근 B. burgdorferi에서 전사 인자의 역할을 연구하는 데 사용되었으며 다른 전사 인자, 시그마 인자 및 분자23을 사용하여 유사한 실험을 구축하는 데 적용될 수 있습니다. B. burgdorferi의 활성 RNA 중합효소를 얻고 그 활성이 검출되면 시험관 내 전사 분석 내의 구성 요소 및 조건을 수정할 수 있습…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 Creighton University의 Health Sciences Strategic Investment Fund Faculty Development Grant의 지원을 받았습니다. B. burgdorferi RpoC-His10X 균주는 몬태나 대학의 D. Scott Samuels 박사가 친절하게 제공했습니다. 맥아당 결합 단백질 태그가 부착된 rpoD 대립유전자를 암호화하는 pMAL-C5X 플라스미드를 보유하는 대장균 균주는 NIH NIAID에 있는 Rocky Mountain Laboratories의 Frank Gherardini 박사가 친절하게 제공했습니다.

Materials

0.45 micron syringe filter Thermo Scientific 726-2545 Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes MidSci C50B Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes Thermo Scientific 3119-0050PK Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles Thermo Scientific 3120-9500PK Step 1.1
B-PER and instruction manual Thermo Scientific 78248 Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride Fisher Scientific 10035-04-8 Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff Millipore Sigma UFC8010 Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual Thermo Scientific 89969 Step 1.9
Dithiothreitol Acros Organics 426380500 Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease) Millipore Sigma 70746 Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease  Haematologic Technologies HCXA-0060 Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager GE lifesciences Multiple Step 4.15
Gel Imager Bio-Rad Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription Fisher Scientific 7732-18-5 Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit New England Biolabs M0530S Step 3.1
High-speed centrifuge Eppendorf Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL Cytiva Life Sciences 17040601 Step 2.8
Imidazole Sigma-Aldrich 56750-100G Step 1.9
Lysozyme Thermo Scientific 90082 Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride  Fisher Scientific S25401 Step 4.1
Manganese chloride Fisher Scientific S25418 Step 4.1
Mini protean tetra cell Bio-Rad Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40 Thermo Scientific 85124 Step 4.1
NTP mixture Thermo Scientific R0481 Step 4.1
PCR purification kit Qiagen 28506 Step 3.2
PCR tubes MidSci PR-PCR28ACF Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual Cytiva 17085101 Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion
and Purification System Instruction manual		 New England Biolabs E8200S Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD Bio-Rad 456-8125 Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate Sigma-Aldrich G1251 Step 4.1
Protease inhibitor Thermo Scientific 78425 Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP Perkin Elmer BLU503H Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x) New England Biolabs B0363S Step 4.13
Rnase inhibitor Thermo Scientific EO0381 Step 4.1
Spectrophotometer Biotek Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent Bio-Rad 4566033 Step 4.14
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Referenzen

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Boyle, W. K., Sorensen, H. N., Bourret, T. J. Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays. J. Vis. Exp. (185), e64134, doi:10.3791/64134 (2022).
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