Composants essentiels des tests de transcription in vitro de Borreliella (Borrelia) burgdorferi
Summary
Les tests de transcription in vitro peuvent déchiffrer les mécanismes de régulation transcriptionnelle chez Borreliella burgdorferi. Ce protocole décrit les étapes pour purifier l’ARN polymérase de B. burgdorferi et effectuer des réactions de transcription in vitro. Les approches expérimentales utilisant des tests de transcription in vitro nécessitent une purification et un stockage fiables de l’ARN polymérase active.
Abstract
Borreliella burgdorferi est un pathogène bactérien avec des répertoires métaboliques et génomiques limités. B. burgdorferi transite extracellulaire entre les vertébrés et les tiques et remodèle radicalement son profil transcriptionnel pour survivre dans des environnements disparates pendant l’infection. L’un des objectifs des études sur B. burgdorferi est de comprendre clairement comment la bactérie réagit à son environnement par des changements transcriptionnels. Les essais de transcription in vitro permettent de disséquer biochimiquement les mécanismes de base de la régulation transcriptionnelle. Ici, nous présentons un protocole détaillé décrivant la purification et le stockage de l’ARN polymérase de B. burgdorferi , la purification du facteur sigma, la génération de modèles d’ADN et les tests de transcription in vitro . Le protocole décrit l’utilisation de l’ARN polymérase purifiée à partir de B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC est une souche précédemment publiée hébergeant un marqueur 10XHis sur le gène rpoC codant pour la plus grande sous-unité de l’ARN polymérase. Les tests de transcription in vitro consistent en l’ARN polymérase purifiée à partir de la souche 5A4-RpoC, une version recombinante du facteur sigma d’entretien RpoD et un modèle d’ADN double brin généré par PCR. Bien que les techniques de purification des protéines et les approches d’assemblage des tests de transcription in vitro soient conceptuellement bien comprises et relativement courantes, les considérations de manipulation des ARN polymérases diffèrent souvent d’un organisme à l’autre. Le protocole présenté ici est conçu pour des études enzymatiques sur l’ARN polymérase de B. burgdorferi. La méthode peut être adaptée pour tester le rôle des facteurs de transcription, des promoteurs et des modifications post-traductionnelles sur l’activité de l’ARN polymérase.
Introduction
La maladie de Lyme et la fièvre récurrente sont causées par des spirochètes pathogènes des genres Borrelia et Borreliella 1,2,3. La maladie de Lyme est une maladie à transmission vectorielle importante en Amérique du Nord et, par conséquent, Borreliella burgdorferi est un organisme modèle important pour étudier la biologie des spirochètes 4,5. Les recherches sur les mécanismes de régulation transcriptionnelle de B. burgdorferi visent à mieux comprendre ses adaptations aux changements de l’environnement lorsqu’il circule entre son vecteur tique et ses hôtes mammifères 6,7. Les changements de pH, de température, d’osmolarité, de disponibilité des nutriments, d’acides gras à chaîne courte, d’acides organiques et d’oxygène dissous et de dioxyde de carbone modulent l’expression de gènes importants pour la survie de B. burgdorferi dans son vecteur arthropode et pour infecter les animaux 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Relier ces réponses à des stimuli avec des mécanismes de régulation a été un aspect important de la recherche sur B. burgdorferi 19.
Les facteurs de transcription et les facteurs sigma contrôlent la transcription des gènes qui effectuent des processus cellulaires. Les spirochètes de la maladie de Lyme et de la fièvre récurrente abritent un ensemble relativement clairsemé de facteurs de transcription et de facteurs sigma alternatifs. Malgré cela, il existe des changements transcriptionnels complexes qui dirigent les réponses de B. burgdorferi à l’environnement20,21,22. Les mécanismes spécifiques à l’origine des changements transcriptionnels chez B. burgdorferi en réponse aux changements environnementaux restent incertains. Les tests de transcription in vitro sont des outils puissants pour utiliser une approche biochimique pour tester la fonction et les mécanismes de régulation des facteurs de transcription et des facteurs sigma23,24,25,26.
Un système de dosage de transcription in vitro utilisant l’ARN polymérase de B. burgdorferi a récemment été mis en place24. Comme les bactéries ont souvent une physiologie cellulaire unique, les ARN polymérases de différentes espèces et genres réagissent différemment à la purification enzymatique, au stockage enzymatique et aux conditions tampons de réaction27. B. burgdorferi est également génétiquement éloigné des nombreuses espèces bactériennes chez lesquelles les ARN polymérases ont été étudiées20. Des aspects de la préparation enzymatique tels que les conditions tampons de lyse, de lavage et d’élution, le tampon de stockage, le tampon de réaction de transcription in vitro et la méthode de construction du test peuvent tous modifier l’activité de l’ARN polymérase. Ici, nous fournissons un protocole pour la purification de l’ARN polymérase et du facteur sigma RpoD, la production d’un modèle d’ADN double brin linéaire et la construction de tests de transcription in vitro pour faciliter la reproductibilité entre les laboratoires utilisant ce système. Nous détaillons un exemple de réaction pour démontrer la plage linéaire pour la transcription dépendante de RpoD et discutons des limites et des alternatives à cette approche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des tests de transcription in vitro construits à l’aide du protocole présenté ont récemment été utilisés pour étudier le rôle d’un facteur de transcription chez B. burgdorferi et peuvent être appliqués pour construire des expériences similaires en utilisant d’autres facteurs de transcription, facteurs sigma et molécules23. Une fois que l’ARN polymérase active de B. burgdorferi a été obtenue et que son activité a été détectée, les composants e…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention de perfectionnement du corps professoral du Fonds d’investissement stratégique en sciences de la santé de l’Université Creighton. La souche RpoC-His10X de B. burgdorferi a été aimablement fournie par le Dr D. Scott Samuels de l’Université du Montana. La souche E. coli hébergeant le plasmide pMAL-C5X codant pour un allèle rpoD marqué par une protéine de liaison au maltose a été aimablement fournie par le Dr Frank Gherardini de Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.
Materials
| 0.45 micron syringe filter | Thermo Scientific | 726-2545 | Step 1.7 and 2.3 |
| 50 mL conical tubes | MidSci | C50B | Step 1.3, and subsequent steps |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Thermo Scientific | 3119-0050PK | Step 1.2 |
| 500 mL Centrifuge bottles | Thermo Scientific | 3120-9500PK | Step 1.1 |
| B-PER and instruction manual | Thermo Scientific | 78248 | Step 1.4 and 2.2 |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Step 2.6 |
| Centrifugal filters 10 Kd cutoff | Millipore Sigma | UFC8010 | Step 1.11 and 2.11 |
| Cobalt resin and instruction manual | Thermo Scientific | 89969 | Step 1.9 |
| Dithiothreitol | Acros Organics | 426380500 | Step 1.4 and subsequent steps |
| Dnase (Nuclease) | Millipore Sigma | 70746 | Step 1.4 and 2.2 |
| Factor Xa Protease | Haematologic Technologies | HCXA-0060 | Step 2.6 |
| GE Typhoon 5 Phosphoimager | GE lifesciences | Multiple | Step 4.15 |
| Gel Imager | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| H2O for in vitro transcription | Fisher Scientific | 7732-18-5 | Step 3.2 and 3.3 |
| high fidelity PCR kit | New England Biolabs | M0530S | Step 3.1 |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | Step 1.1, and subsequent steps | |
| HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva Life Sciences | 17040601 | Step 2.8 |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-100G | Step 1.9 |
| Lysozyme | Thermo Scientific | 90082 | Step 1.4 and 2.2 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | S25401 | Step 4.1 |
| Manganese chloride | Fisher Scientific | S25418 | Step 4.1 |
| Mini protean tetra cell | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | Step 4.1 |
| NTP mixture | Thermo Scientific | R0481 | Step 4.1 |
| PCR purification kit | Qiagen | 28506 | Step 3.2 |
| PCR tubes | MidSci | PR-PCR28ACF | Step 1.12 |
| PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual | Cytiva | 17085101 | Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column) |
| pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual |
New England Biolabs | E8200S | Step 2.1 |
| Polyacrylamide gels AnyKD | Bio-Rad | 456-8125 | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Step 4.1 |
| Protease inhibitor | Thermo Scientific | 78425 | Step 1.4 and 2.2 |
| Radiolabeled ATP | Perkin Elmer | BLU503H | Step 4.2 |
| RNA Loading Dye, (2x) | New England Biolabs | B0363S | Step 4.13 |
| Rnase inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | Step 4.1 |
| Spectrophotometer | Biotek | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| TBE-Urea gels 10 percent | Bio-Rad | 4566033 | Step 4.14 |
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