Test de perméabilité épithéliale dans les entéroïdes dérivés du tissu fœtal

La collecte de tissus humains a été approuvée par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Washington (ID d’étude: STUDY380 et CR ID: CR3603) et réalisée par le Birth Defects Research Laboratory. Le laboratoire de recherche sur les malformations congénitales a été soutenu par le NIH numéro de récompense 5R24HD000836 de l’Institut national Eunice Kennedy Shriver de la santé infantile et du développement humain. Les échantillons ont été prélevés auprès de participants consentants et envoyés comme étant anonymisés et sans aucune information sur la santé. Les échantillons de l’intestin grêle ont été entreposés dans la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco et postés pendant la nuit au laboratoire de réception. 1. Préparation du réactif REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour obtenir la liste des réactifs et les numéros de catalogue. Les volumes recommandés sont pour une plaque de 6 puits, sauf indication contraire. Préparer de l’albumine sérique bovine (BSA) à 0,1 % en dissolvant 50 mg de poudre de BSA dans 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 100 μg/mL d’un antibiotique primocine à large spectre pour enduire tous les articles en plastique et les embouts qui entrent en contact avec les tissus ou les entéroïdes.Pour enrober de BSA, placer les pointes de pipettes non filtrées dans un tube conique de 50 ml avec suffisamment de BSA pour couvrir les pointes, ajouter 1 à 2 mL de BSA pour couvrir la surface de la boîte de Petri ou remplir des tubes coniques de 15 ml avec du BSA pendant au moins 20 à 30 minutes à température ambiante avant utilisation. Préparer le milieu DPBS en mélangeant 50 mL de DPBS avec 100 μg/mL de primocine et 50 μg/mL de gentamicine. Préparer ce milieu avec et sans 2,5 μg/mL d’amphotéricine. Préparer le milieu de croissance entéroïde en mélangeant 2 mL de milieu de croissance organoïde, 100 μg/mL de primocine, 10 μM Y27632 et 2,5 μM CHIR99021. Faire du média frais tous les jours et le réchauffer dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C.NOTA: Le facteur de dilution pour Y27632 est de 1:250. Pour CHIR99021, diluer la solution mère CHIR à 1:100 dans un milieu chaud, puis à 1:40 dans un milieu de croissance entéroïde pour obtenir une dilution de 1:4000. Préparer le mélange de matrice membranaire basale en ajoutant à la matrice membranaire basale 10 μM Y27632 et 2,5 μM CHIR99021. Faire un total de 285 μL du mélange final de matrice membranaire basale à une concentration de protéines de 8 mg/mL pour un puits d’une plaque de 6 puits.REMARQUE: La matrice de membrane de base doit être glacée pour rester sous forme liquide et se solidifiera à des températures plus chaudes. La concentration en protéines de la matrice membranaire basale mère détermine le volume requis pour obtenir une concentration finale de protéines de 8 mg/mL à l’aide de l’équation suivante :Volume 1 × Concentration 1 = Volume 2 × Concentration 2 Préparer le paraformaldéhyde (PFA) à 4 % en diluant le PFA à 32 % dans du PBS de 1:8 et conserver à température ambiante. Faire 0,5 mL pour chaque puits d’entéroïdes à fixer. Préparez un tampon de blocage en ajoutant 5% de sérum de chèvre et 0,5% de Triton X-100 dans du PBS. Préparer 1 mL pour le premier anticorps par puits et 0,5 mL pour l’anticorps supplémentaire par puits.REMARQUE : Utilisez du sérum de la même espèce que l’hôte des anticorps secondaires. Préparer des anticorps primaires et secondaires, dilués dans un tampon de blocage à la concentration recommandée par le fabricant pour chaque anticorps. Préparer 5 μg/mL de Dmidino-2-phénylindole (DAPI) en diluant à 1:200 à partir de 1 mg/mL de solution mère dans du PBS. Faire 0,5 mL par puits d’entéroïdes colorés. Préparer 70% de glycérol dans PBS et faire 0,5 mL pour monter les entéroïdes sur des lames de microscope. Préparer 5 mg/mL de dextran-FITC (fluorescéine-isothiocyanate) en diluant la solution mère à 25 mg/mL dans du PBS dans un rapport de 1:5. Faire 20 μL pour la micro-injection. Préparer les lipopolysaccharides (LPS) et le dextran-FITC en reconstituant la poudre de LPS dans du PBS en une solution mère à 5 mg/mL. Diluer les solutions mères de LPS et de dextran dans du PBS à 0,1 mg/mL et 0,5 mg/mL de LPS et 5 mg/mL de dextran-FITC. Faire 20 μL pour la micro-injection. Préparer l’acide éthylèneglycol-bis(β-aminoéthyléther)-N,N,N’,N’-tétraacétique (EGTA) en faisant une solution mère de 0,2 M en dissolvant la poudre d’EGTA dans de l’eau distillée et en ajustant le pH à environ 8 à l’aide d’acide chlorhydrique (HCl). Préparer une concentration d’essai de 2 mM dans des milieux de culture en effectuant une dilution de 1:100. 2. Prélèvement de spécimens Une fois les échantillons reçus, effectuer l’isolement et le placage des cellules épithéliales dans les 24 heures suivant le prélèvement de l’échantillon. 3. Placage des cellules épithéliales intestinales dans la matrice membranaire basale à partir d’échantillons entiers REMARQUE: Cette procédure suit les protocoles modifiés du Laboratoire de modélisation tissulaire translationnelle de l’Université du Michigan12,13,14. L’utilisation de milieux de croissance avec un facteur Wnt élevé donne des résultats cohérents pour l’établissement entéroïde. Une fois les entéroïdes établis, utilisez le même milieu avec un facteur Wnt élevé pour conduire les entéroïdes à des formes sphériques pour la micro-injection. Transférer les segments intestinaux dans une boîte de Petri de 60 mm x 15 mm avec du DPBS glacé avec de l’amphotéricine et laisser tremper pendant 20 minutes sur de la glace. Pendant que le tissu trempe, identifiez les régions (duodénum, jéjunum ou iléon) de l’intestin grêle et retirez le tissu conjonctif et les vaisseaux sanguins avec une pince et des ciseaux. Lavez la teneur en lumière au besoin à l’aide d’une petite aiguille de 23 à 25 G et d’une seringue de 3 ml sans perturber l’épithélium. Couper les segments intestinaux en morceaux de 3 à 5 mm à l’aide d’un scalpel et placer 1 à 2 morceaux (pour placage dans un puits d’une plaque de 6 puits) dans une boîte de Petri de 35 mm x 15 mm contenant 0,5 à 1 mL de milieu de croissance organoïde sur de la glace. À l’aide de micro-ciseaux et de pinces à dissection, couper le tube intestinal longitudinalement. Utilisez l’embout de la pince pour gratter les cellules épithéliales du fascia sous un stéréomicroscope 10x. Retirez le fascia et faites tourbillonner le plat pour briser les amas de cellules. Utiliser un embout coupé à pipette de 20 μL pour transférer les cellules et les milieux par incrément de 5 à 10 μL dans le mélange de matrice membranaire basale pour obtenir une solution de 285 μL à une concentration de protéines de la matrice de 8 mg/mL. Monter et descendre lentement 20x pour mélanger les cellules dans la matrice membranaire basale sur la glace à l’aide d’une pointe coupée de 200 μL. Placer cinq bandes de 50 μL du mélange matriciel membranaire de la base cellulaire dans un puits d’une plaque de 6 puits préchauffée conservée sur une brique de mousse chaude. Incuber la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 5% de CO2 pendant 10 min pour permettre à la matrice membranaire basale de polymériser et de durcir. Ajouter 2 mL du milieu de croissance entéroïde dans le puits des bandes de matrice membranaire basale solidifiées et le remettre à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire. Changez le média quotidiennement pour stimuler la croissance des entéroïdes. Vérifiez quotidiennement la différenciation des cellules souches intestinales au microscope inversé 10x. Après 10-14 jours, passez les entéroïdes dans un puits d’une plaque de 12 puits ou 6 puits, selon la densité entéroïde. Commencez à changer le média tous les deux jours et passez dans un rapport de 1: 2 tous les 5-7 jours que les entéroïdes commencent à se développer.Enlevez les cellules qui ne se différencient pas en entéroïdes avec la couche matricielle de la membrane basale pendant les passages. Créer un stock congelé d’entéroïdes à faible passage en les congelant dans 80 % de milieux de croissance, 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO), si nécessaire. 4. Coloration immunofluorescente des entéroïdes REMARQUE: Le processus de fixation et de coloration prend 3 jours. Dans ce protocole, nous avons fixé et coloré les noyaux (DAPI), les marqueurs épithéliaux (villin, CDX2), le lysozyme, la mucine et les protéines de jonction serrée (claudine 2, claudine 3, occludine, zonula occluden-1) en utilisant un protocole modifié15. Les images fluorescentes ont été prises par un microscope confocal. FixageNOTE: Ce processus est généralement effectué en même temps que le passage entéroïde ou la procédure de congélation.Placez la plaque entéroïde sur de la glace. Retirez le milieu de culture et lavez doucement 2x avec du DPBS froid. Identifier les entéroïdes à fixer et à colorer. Transférez-les dans une plaque de 12 puits en les pipetant soigneusement avec une pointe coupée de 200 μL ou en utilisant une boucle d’inoculation de 1 μL. Placez les entéroïdes dans des puits séparés si une coloration avec différents anticorps doit être effectuée. Retirez autant de liquide que possible avec un embout de 200 μL sans perturber les entéroïdes. Ajouter 0,5 mL de PFA à 4 % et incuber pendant 30 min à température ambiante. Remuer la plaque de temps en temps pour faciliter le détachement des entéroïdes de la matrice membranaire basale. Examiner grossièrement pour déterminer le détachement des entéroïdes de la matrice membranaire basale. Aspirer soigneusement et jeter le PFA liquide sans perturber les entéroïdes. Laver avec PBS 3x pour éliminer le PFA et toute matrice résiduelle de membrane basaleREMARQUE: L’aspiration du liquide sous un stéréomicroscope peut être utile pour éviter les entéroïdes. Les entéroïdes fixes peuvent être conservés dans du PBS à 4 °C jusqu’à 1 mois. BloquantRetirez délicatement le PBS résiduel à l’aide d’une pipette de 200 μL, sans perturber les entéroïdes. Ajouter 0,5 mL de tampon bloquant et incuber pendant 2 h à température ambiante. Retirez et jetez le tampon de blocage à l’aide d’une pipette de 200 μL, en prenant soin de ne pas perturber les entéroïdes. Coloration des anticorpsAjouter 500 μL d’anticorps primaire dans un tampon de blocage à chaque puits contenant des entéroïdes. Pour les anticorps primaires et pour le lysozyme, le facteur de dilution est de 1:100, pour CDX2 le facteur de dilution est de 1:100 et pour la villosline, le facteur de dilution est de 1:50. Incuber à 4 °C pendant une nuit. Le lendemain, retirez la solution d’anticorps et lavez 3x avec du PBS. Prévoir 10 à 15 minutes de temps d’incubation pour chaque lavage. Répétez les étapes 4.3.1.-4.3.2. pour l’anticorps secondaire avec un facteur de dilution de 1:400. Ajouter 500 μL de DAPI à 5 μg/mL dans du PBS et incuber à température ambiante pendant 15 min. Après l’incubation, laver 3x avec PBS et prévoir 10-15 min de temps d’incubation pour chaque lavage MontageSupprimez autant de PBS que possible. Lavez les entéroïdes colorés avec 70% de glycérol 1x. Soulevez les entéroïdes hors de la plaque à l’aide d’une boucle d’inoculation de 1 μL ou d’une pointe coupée de 200 μL et montez avec 70% de glycérol sur une lame de microscope en verre. Pour préserver la structure 3D des entéroïdes, assurez-vous d’un espace de 0,5 à 1 mm entre la lame de verre inférieure et la lamelle de couverture. Utilisez des découpes de fine feuille de caoutchouc de silicone ou de couvercle en verre pour créer un espace entre la lame de verre et la lamelle de couverture. Les entéroïdes peuvent maintenant être imagés avec un microscope confocal. 5. Préparation pour micro-injection d’entéroïdes REMARQUE : Le protocole de microinjection est un protocole modifié de Hill et coll.16 pour s’adapter aux ressources et au contexte. Certaines des étapes de préparation doivent être complétées quelques jours à l’avance. Configuration de la configuration de la micro-injectionInstaller l’appareil de micro-injecteur soit à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité, soit sur un comptoir propre, selon l’objectif des expériences, comme suit: un stéréomicroscope pour la visualisation, un micromanipulateur avec des nobs de contrôle des axes X, Y et Z montés sur un support lourd à côté du microscope, un support de micropipette monté sur le bras du micromanipulateur, un tube de micro-injecteur reliant le support de micropipette et une seringue avec un robinet d’arrêt à trois voies, puis à une pompe pneumatique et à une source d’air murale connectée à la pompe (Figure 1). Désinfecter l’appareil de micro-injection avec de l’éthanol à 70 % avant et après l’utilisation expérimentale. Testez le positionnement du microscope et du micromanipulateur pour qu’il corresponde aux spécifications physiques souhaitées, y compris en déplaçant les boutons d’axe pour vous assurer que la micropipette peut atteindre l’échantillon ciblé. Préparation de la micropipetteRemarque : Effectuez ces étapes à l’avance.Utilisez un extracteur de micropipettes pour tirer les tubes capillaires en verre dans les micropipettes. Sous le stéréomicroscope, placez la micropipette sur un support de micropipette horizontal (Figure 2), concentrez-vous sur les pointes et coupez les pointes à l’aide d’une paire de micro-ciseaux tout en regardant à travers les oculaires du microscope. Préparez environ 10 à 15 micropipettes à une pointe de taille similaire pour chaque expérience. Testez la taille de la pointe en tirant vers le haut 0,5-1 μL de liquide et comptez combien de pompes sont nécessaires pour vider le volume. Testez plusieurs tailles de pointe pour trouver la taille appropriée pour l’expérience. Une taille de pointe appropriée éjecte environ 10 à 30 nL de volume par pompe. Conservez les micropipettes en verre coupé dans une boîte ou un tube propre sans endommager les embouts.REMARQUE : Les micropipettes prédécoupées sont disponibles dans le commerce. Préparation entéroïdePlacez une assiette composée principalement d’entéroïdes gros et sphériques sur de la glace. Remplacez l’ancien milieu de croissance par un milieu frais. Dissociez délicatement les points de la matrice de la membrane basale de la plaque à l’aide d’un élévateur de cellule. Faites tourbillonner les points de gel d’un côté à l’autre sur la glace pour briser la matrice de la membrane basale sans déranger les entéroïdes. Sélectionner environ 10 à 15 entéroïdes sphériques avec une pointe de pipette coupée de 20 μL au microscope stéréoscopique et les ajouter à la matrice membranaire basale pour obtenir 285 μL de mélange de concentration de protéines de 8 mg/mL. Pipeter doucement de haut en bas avec une pointe coupée de 200 μL pour mélanger les entéroïdes sans les casser. Plaquez cinq points de gel de 50 μL au centre d’une boîte de Petri ronde de culture cellulaire de 35 mm x 10 mm ou d’une boîte de Pétri de dimensions similaires. Incuber les points de gel entéroïde à 37 °C pendant 10 min pour les solidifier. Ensuite, ajoutez 1 mL de milieu de croissance frais dans le plat. Incuber les entéroïdes pendant au moins 2-3 jours pour la stabilisation et jusqu’à ce que les entéroïdes atteignent une taille appropriée de 0,5-1 μL.NOTE: Il est important d’avoir une boîte avec une paroi basse pour un accès plus facile aux entéroïdes et un petit diamètre pour moins de volume de milieu de croissance. Microinjection de dextran-FITC et de matériel testéTournez le robinet d’arrêt à trois voies vers la pompe pneumatique. Remplissez la micropipette avec le matériau injecté, dans ce cas dextran-FITC avec ou sans LPS. Préparez une boîte de Petri recouverte d’une bande de film transparent. Placez deux à quatre points de 1 μL de matériau injecté sur le film. Utilisez le micromanipulateur pour conduire l’extrémité de la micropipette juste à l’intérieur du liquide, mais au-dessus du film sous la visualisation d’un stéréomicroscope. Tirez doucement sur la seringue pour retirer le matériau injecté dans la micropipette. Remplissez la micropipette avec 2-4 μL de matériau injecté et appuyez sur la seringue pour éliminer tout air à l’extrémité de la micropipette. Inspectez la colonne de matériau injecté dans la micropipette pour vous assurer qu’il n’y a pas de poche d’air. Notez le volume de matière injectée qui s’est retirée à l’intérieur de la micropipette.REMARQUE: Le liquide est visible dans une couleur verdâtre en raison de dextran-FITC. Allumez la source d’air connectée à la pompe pneumatique, qui fournit une pression d’air d’environ 60 psi. Allumez la pompe et réglez la durée de la pompe sur 10-15 ms. Tournez le robinet d’arrêt de la seringue pour ouvrir la conduite de la pompe à la micropipette.REMARQUE: La durée plus longue de la pompe permet de libérer plus de matériau par pompe. Il est recommandé d’utiliser la même durée de pompe et des micropipettes avec des tailles d’embout similaires pour toute l’expérience pour estimer le volume injecté. Retirez les entéroïdes de l’incubateur de culture cellulaire et placez les plats sur une brique de mousse chaude dans un récipient couvert pour limiter l’exposition à la lumière après la micro-injection. Placez la boîte de Petri avec entéroïdes sous le stéréomicroscope et déplacez les boutons du micromanipulateur pour placer l’extrémité de la micropipette à un angle d’environ 35°-45° par rapport à la surface horizontale (Figure 3). Cela nécessite une certaine pratique à l’avance. Visualisez et cartographiez les entéroïdes dans chaque boîte de Petri au microscope pour faire un plan pour injecter environ 3-5 entéroïdes sphériques par boîte. Une fois que l’extrémité de la micropipette est proche de la surface du liquide, regardez dans les oculaires du microscope pour avancer la pointe vers l’entéroïde ciblé. Percez l’entéroïde avec la pointe de la micropipette en avançant le bouton de l’axe z à l’aide d’un mouvement lent précis. La paroi entéroïde va s’enfoncer et revenir une fois que la pointe traverse la surface entéroïde, après quoi l’avancement devrait s’arrêter. Appuyez sur la pédale de pompe avec un pied et remplissez l’entéroïde avec la solution verdâtre de dextran-FITC jusqu’à ce qu’elle soit légèrement dilatée. Noter le nombre de pompes pour calculer le volume pompé et la concentration de dextran. Retirez l’embout de la micropipette après avoir terminé la micro-injection et passez à l’entéroïde suivant. Avec de la pratique, le processus peut se dérouler sans heurts.Si l’embout se casse, remplacez-le par une autre micropipette avec une taille d’embout similaire. Tirez suffisamment de volume de matière injectée pour tous les entéroïdes du même groupe d’exposition et changez la micropipette entre les matières injectées pour éviter la contamination croisée. Placez le plat entéroïde injecté sous le couvert pour éviter l’exposition à la lumière. Collecte et mesure Dextran-FITCAprès la procédure de micro-injection, retirez immédiatement le milieu de culture. Laver avec un milieu de croissance frais 2x pour éliminer tout résidu de dextran-FITC. Ajoutez un nouveau média et enregistrez le temps comme temps 0 après la micro-injection.REMARQUE: Vous aurez peut-être besoin d’une deuxième personne pour effectuer cette étape sans perturber le processus de micro-injection. Prélever 200 μL de milieu de culture dans un tube opaque de 0,5 mL, puis remplacer le milieu de culture retiré par le même volume de milieu de culture frais à 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h et 12 h après les microinjections.Remarque : L’intervalle de temps peut varier en fonction de l’expérience. En cas d’exposition basolatérale, le milieu de remplacement doit contenir l’exposition à la même concentration. Conserver les milieux de culture collectés à 4 °C et mesurer la concentration de dextrane en 24 h. Conservez les milieux restants à −80 °C pour d’autres analyses. À la fin de la collecte des milieux de culture, récoltez les entéroïdes pour l’extraction ou l’imagerie de l’ARN, si nécessaire. Mesurez les concentrations de dextran-FITC à l’aide d’un lecteur de microplaques à fluorescence. Construire une courbe standard pour chaque plaque en utilisant des dilutions en série et en ajustant une droite de régression linéaire comme le montre la figure 4. Corriger l’absorbance du volume retiré des milieux de culture contenant du dextrane qui a été remplacé par un milieu de croissance frais sans dextran comme suit : l’élimination de 200 μL sur 2 mL de milieu de culture représente 10 % en volume.Absorbance corrigée à 2 h = (absorbance à 1 h x 10%) + absorbance mesurée à 2 hL’absorbance du premier milieu corrigé n’a pas besoin de correction. Ensuite, calculez la concentration de dextrane à partir de la valeur d’absorbance corrigée à l’aide de l’équation de la courbe standard. Pour la normalisation, diviser la concentration de dextrane par le nombre total de pompes pour chaque boîte de Pétri, puis multiplier par le plus grand nombre total de pompes par boîte.NOTE: Toutes les expositions sont effectuées en trois exemplaires (trois boîtes de Petri par exposition avec 3 à 5 entéroïdes micro-injectés par boîte). Les valeurs moyennes des triplicates sont comparées entre les expositions à l’aide d’un test t de Student.