Testen van epitheliale permeabiliteit bij foetale weefsel-afgeleide enteroïden

De collectie menselijk weefsel werd goedgekeurd door de University of Washington Institutional Review Board (studie-ID: STUDY380 en CR ID: CR3603) en uitgevoerd door het Birth Defects Research Laboratory. Het Birth Defects Research Laboratory werd ondersteund door NIH-prijsnummer 5R24HD000836 van het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development. De monsters werden verzameld van instemmende deelnemers en verzonden als gedeïdentificeerd en zonder enige gezondheidsinformatie. De dunne darmmonsters werden opgeslagen in ijskoude Dulbecco’s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) en ‘s nachts naar het ontvangende laboratorium gestuurd. 1. Reagensbereiding OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor een lijst met reagentia en catalogusnummers; de aanbevolen volumes zijn voor een 6-wells plaat, tenzij anders vermeld. Bereid 0,1% runderserumalbumine (BSA) door 50 mg BSA-poeder op te lossen in 50 ml fosfaatbuffered zoutoplossing (PBS) met 100 μg / ml van een breedspectrumantibiotische primocine om al het plasticgoed en de tips die in contact komen met weefsels of enteroïden te coaten.Om te coaten met BSA, plaatst u niet-gefilterde pipetpunten in een conische buis van 50 ml met voldoende BSA om de uiteinden te bedekken, voegt u 1-2 ml BSA toe om het oppervlak van de petrischaal te bedekken of vult u 15 ml conische buizen met BSA gedurende ten minste 20-30 minuten bij kamertemperatuur voorafgaand aan gebruik. Bereid DPBS-media door 50 ml DPBS te mengen met 100 μg/ml primocine en 50 μg/ml gentamicine. Bereid deze media met en zonder 2,5 μg/ml amfotericine. Bereid enteroïde groeimedia door 2 ml organoïde groeimedium, 100 μg/ml primocine, 10 μM Y27632 en 2,5 μM CHIR99021 te mengen. Maak dagelijks verse media en verwarm deze in een celkweekincubator bij 37 °C.OPMERKING: De verdunningsfactor voor Y27632 is 1:250. Verdun voor CHIR99021 de CHIR-stamoplossing tot 1:100 in warme media en vervolgens tot 1:40 in enteroïde groeimedia om een verdunning van 1:4000 te bereiken. Bereid keldermembraanmatrixmix voor door aan de voorraad keldermembraanmatrix 10 μM Y27632 en 2,5 μM CHIR99021 toe te voegen. Maak in totaal 285 μL van de uiteindelijke keldermembraanmatrixmix bij een eiwitconcentratie van 8 mg / ml voor één put van een 6-wellsplaat.OPMERKING: Keldermembraanmatrix moet ijskoud zijn om in vloeibare vorm te blijven en zal stollen bij warmere temperaturen. De eiwitconcentratie van de voorraadkeldermembraanmatrix bepaalt het volume dat nodig is om een uiteindelijke eiwitconcentratie van 8 mg / ml te maken met behulp van de vergelijking:Volume 1 × Concentratie 1 = Volume 2 × Concentratie 2 Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) door de 32% voorraad PFA in PBS met 1:8 te verdunnen en bij kamertemperatuur te bewaren. Maak 0,5 ml voor elke put van enteroïden die moet worden gefixeerd. Bereid de blokkerende buffer voor door 5% geitenserum en 0,5% Triton X-100 in PBS toe te voegen. Bereid 1 ml voor het eerste antilichaam per put en 0,5 ml voor het extra antilichaam per put.OPMERKING: Gebruik serum van dezelfde soort als de gastheer van de secundaire antilichamen Bereid primaire en secundaire antilichamen, verdund in blokkerende buffer in de door de fabrikant aanbevolen concentratie voor elk antilichaam. Bereid 5 μg/ml Dmidino-2-fenylindool (DAPI) door verdunning tot 1:200 van 1 mg/ml stamoplossing in PBS. Maak 0,5 ml per putje gekleurde enteroïden. Bereid 70% glycerol in PBS en maak 0,5 ml voor het monteren van de enteroïden op microscoopglaasjes. Bereid 5 mg/ml dextran-FITC (fluoresceïne-isothiocyanaat) door de 25 mg/ml stamoplossing in PBS te verdunnen met een verhouding van 1:5. Maak 20 μL voor micro-injectie. Bereid lipopolysacchariden (LPS) en dextran-FITC door het LPS-poeder in PBS te reconstitueren tot een 5 mg/ml stockoplossing. Verdunde stamoplossingen van LPS en dextran in PBS tot 0,1 mg/ml en 0,5 mg/ml LPS en 5 mg/ml dextran-FITC. Maak 20 μL voor micro-injectie. Bereid ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra-azijnzuur (EGTA) door een stamoplossing van 0,2 M te maken door EGTA-poeder op te lossen in gedestilleerd water en de pH aan te passen aan ongeveer 8 met behulp van zoutzuur (HCl). Bereid een testconcentratie van 2 mM in kweekmedia voor door een verdunning van 1:100 uit te voeren. 2. Verzameling van specimens Zodra de monsters zijn ontvangen, voert u epitheelcelisolatie en -beplating uit binnen 24 uur na de monsterverzameling. 3. Intestinale epitheelcelplating in keldermembraanmatrix van hele monsters OPMERKING: Deze procedure volgt op gewijzigde protocollen van het Translational Tissue Modeling Laboratory aan de Universiteit van Michigan 12,13,14. Het gebruik van groeimedia met een hoge Wnt-factor levert consistente resultaten op voor enteroïde vestiging. Zodra de enteroïden zijn vastgesteld, gebruikt u dezelfde media met een hoge Wnt-factor om de enteroïden naar bolvormige vormen te drijven voor micro-injectie. Breng de darmsegmenten over in een petrischaaltje van 60 mm x 15 mm met ijskoude DPBS met amfotericine en laat 20 minuten weken op ijs. Terwijl het weefsel doorweekt, identificeert u de regio’s (twaalfvingerige darm, jejunum of ileum) van de dunne darm en verwijdert u het bindweefsel en de bloedvaten met een tang en een schaar. Was het lumengehalte indien nodig uit met een kleine naald van 23-25 G en een spuit van 3 ml zonder het epitheel te verstoren. Snijd de darmsegmenten in stukken van 3-5 mm met behulp van een scalpel en plaats 1-2 stukjes (voor beplating in een putje van een 6-well plaat) in een petrischaal van 35 mm x 15 mm die 0,5-1 ml organoïde groeimedium op ijs bevat. Met behulp van een ontleedmicroschaar en tang knipt u de darmbuis in de lengterichting door. Gebruik de tip van de tang om de epitheelcellen van de fascia te schrapen onder een 10x stereomicroscoop. Verwijder de fascia en draai de schaal om de klonten cellen te breken. Gebruik een 20 μL pipet gesneden tip om de cellen en media in stappen van 5-10 μL over te brengen naar de keldermembraanmatrixmix om een 285 μL-oplossing te maken bij een matrixeiwitconcentratie van 8 mg / ml. Pipetteer langzaam op en neer 20x om cellen in keldermembraanmatrix op ijs te mengen met behulp van een 200 μL gesneden punt. Plaats vijf stroken van 50 μL van het celkeldermembraanmatrixmengsel in één putje van een voorverwarmde 6-well plaat op een warme schuimsteen. Incubeer de plaat in de celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 10 minuten om de keldermembraanmatrix te laten polymeriseren en uitharden. Voeg 2 ml van de enteroïde groeimedia toe aan de put van de gestolde keldermembraanmatrixstrips en plaats terug in de celkweekincubator. Verander de media dagelijks om de enteroïde groei te stimuleren. Controleer dagelijks op intestinale stamceldifferentiatie onder een 10x omgekeerde microscoop. Na 10-14 dagen, passeer de enteroïden in een put van een 12-well of 6-well plaat, afhankelijk van de enteroïde dichtheid. Begin om de dag met het veranderen van de media en passeer in een verhouding van 1: 2 om de 5-7 dagen als de enteroïden beginnen te gedijen.Verwijder de cellen die niet differentiëren in enteroïden met de keldermembraanmatrixlaag tijdens passages. Maak een bevroren voorraad enteroïden met een lage doorgang door ze in te vriezen in 80% groeimedia, 10% foetaal runderserum (FBS) en 10% dimethylsulfoxide (DMSO), indien nodig. 4. Immunofluorescente kleuring van enteroïden OPMERKING: Het proces van fixeren en beitsen duurt 3 dagen. In dit protocol hebben we gefixeerd en gekleurd voor kernen (DAPI), epitheliale markers (villine, CDX2), lysozym, mucine en tight junction-eiwitten (claudine 2, claudine 3, occludin, zonula occluden-1) met behulp van een gewijzigd protocol15. Fluorescerende beelden werden gemaakt door een confocale microscoop. VaststellingOPMERKING: Dit proces wordt meestal tegelijkertijd met de enteroïde passage of bevriezingsprocedure uitgevoerd.Leg de enteroïde plaat op ijs. Verwijder de groeimedia en was 2x voorzichtig met koude DPBS. Identificeer de enteroïden die moeten worden gefixeerd en gekleurd. Breng ze over op een 12-wells plaat door ze voorzichtig te pipetteren met een 200 μL gesneden punt of met behulp van een 1 μL inenterende lus. Plaats enteroïden in afzonderlijke putjes als kleuring met verschillende antilichamen moet worden gedaan. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof met een tip van 200 μL zonder de enteroïden te verstoren. Voeg 0,5 ml 4% PFA toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Draai de plaat af en toe om het losmaken van de enteroïden uit de keldermembraanmatrix te vergemakkelijken. Onderzoek grof om het loslating van de enteroïden van de keldermembraanmatrix te bepalen. Zuig de vloeibare PFA voorzichtig op en gooi deze weg zonder de enteroïden te verstoren. Wassen met PBS 3x om PFA en eventuele resterende keldermembraanmatrix te verwijderenOPMERKING: Het opzuigen van de vloeistof onder een stereomicroscoop kan nuttig zijn om de enteroïden te vermijden. Vaste enteroïden kunnen maximaal 1 maand in PBS bij 4 °C worden bewaard. BlokkerenVerwijder de resterende PBS voorzichtig met een pipet van 200 μL, zonder de enteroïden te verstoren. Voeg 0,5 ml blokkeerbuffer toe en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Verwijder en gooi de blokkerende buffer weg met een pipet van 200 μL, waarbij u voorzichtig bent om te voorkomen dat de enteroïden worden verstoord. AntilichaamkleuringVoeg 500 μL primair antilichaam in blokkerende buffer toe aan elke put met enteroïden. Voor primaire antilichamen en voor lysozym is de verdunningsfactor 1:100, voor CDX2 is de verdunningsfactor 1:100 en voor villine is de verdunningsfactor 1:50. Incubeer bij 4 °C ‘s nachts. Verwijder de volgende dag de antilichaamoplossing en was 3x met PBS. Laat 10-15 minuten incubatietijd voor elke wasbeurt. Herhaal stap 4.3.1.-4.3.2. voor het secundaire antilichaam met een verdunningsfactor van 1:400. Voeg 500 μL DAPI toe bij 5 μg/ml in PBS en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Na incubatie, was 3x met PBS en laat 10-15 minuten incubatietijd voor elke wasbeurt MontageVerwijder zoveel mogelijk PBS. Was de gekleurde enteroïden met 70% glycerol 1x. Til de enteroïden uit de plaat met behulp van een inentingslus van 1 μL of een gesneden tip van 200 μL en monteer met 70% glycerol op een glazen microscoopglaasje. Om de 3D-structuur van de enteroïden te behouden, zorgt u voor een ruimte van 0,5-1 mm tussen de onderste glasplaat en de afdekplaat. Gebruik uitsparingen van dunne siliconenrubberen plaat of glazen afdekplaat om een ruimte te creëren tussen de glasplaat en de afdekplaat. De enteroïden kunnen nu worden afgebeeld met een confocale microscoop. 5. Voorbereiding voor micro-injectie van enteroïden OPMERKING: Het micro-injectieprotocol is een aangepast protocol van Hill et al.16 om aan te sluiten bij de bronnen en instellingen. Sommige voorbereidingsstappen moeten een paar dagen van tevoren worden voltooid. De instelling van de micro-injectie instellenPlaats het microinjectorapparaat in een bioveiligheidskast of op een schone toonbank, afhankelijk van het doel van de experimenten, als volgt: een stereomicroscoop om te bekijken, een micromanipulator met X-, Y- en Z-asbesturingsknollen gemonteerd op een zware standaard naast de microscoop, een micropipettehouder gemonteerd op de micromanipulatorarm, een micro-injectorbuis die de micropipettehouder verbindt en een spuit met een driewegstop, vervolgens naar een pneumatische pomp en een wandluchtbron die op de pomp is aangesloten (figuur 1). Desinfecteer het microinjectieapparaat met 70% ethanol voorafgaand aan experimenteel gebruik en daarna. Test de positionering van de microscoop en micromanipulator om aan de gewenste fysieke specificaties te voldoen, inclusief het verplaatsen van de asknoppen om ervoor te zorgen dat de micropipette het beoogde monster kan bereiken. Bereiding van de micropipetteOPMERKING: Voer deze stappen van tevoren uit.Gebruik een micropipettetrekker om de glazen capillaire buisjes in de micropipettes te trekken. Plaats onder de stereomicroscoop de micropipette op een horizontale micropipettehouder (figuur 2), concentreer je op de uiteinden en knip de uiteinden met een microschaar terwijl je door de microscoop oculairs kijkt. Bereid ongeveer 10-15 micropipettes voor op een vergelijkbare tipgrootte voor elk experiment. Test de tipgrootte door 0,5-1 μL vloeistof op te trekken en tel hoeveel pompen nodig zijn om het volume te legen. Test verschillende tipgroottes om de juiste grootte voor het experiment te vinden. Een geschikte tipgrootte werpt ongeveer 10-30 nL volume per pomp uit. Bewaar de geslepen glazen micropipettes in een schone doos of buis zonder de uiteinden te beschadigen.OPMERKING: Voorgesneden micropipettes zijn in de handel verkrijgbaar. Enteroïde voorbereidingPlaats een plaat van meestal grote en bolvormige enteroïden op ijs. Vervang het oude groeimedium door vers medium. Dissociëer de matrixpunten van het keldermembraan voorzichtig van de plaat met een celheffer. Draai de gelpunten van links naar rechts op ijs om de keldermembraanmatrix te breken zonder de enteroïden te storen. Selecteer ongeveer 10-15 bolvormige enteroïden met een gesneden pipetpunt van 20 μL onder een stereomicroscoop en voeg toe aan de keldermembraanmatrix om 285 μL eiwitconcentratiemengsel van 8 mg / ml te maken. Pipetteer voorzichtig op en neer met een gesneden punt van 200 μL om de enteroïden te mengen zonder ze te breken. Plaat vijf 50 μL gel stippen in het midden van een ronde 35 mm x 10 mm celkweek petrischaal of een met vergelijkbare afmetingen. Incubeer de enteroïde gelpunten bij 37 °C gedurende 10 minuten om te stollen. Voeg vervolgens 1 ml vers groeimedium toe aan het gerecht. Incubeer de enteroïden gedurende ten minste 2-3 dagen voor stabilisatie en totdat de enteroïden een geschikte grootte van 0,5-1 μL bereiken.OPMERKING: Het is belangrijk om een schaal te hebben met een lage wand voor gemakkelijkere toegang tot de enteroïden en een kleine diameter voor minder volume groeimedium. Micro-injectie van dextran-FITC en getest materiaalSchakel de driewegstopkraan uit naar de pneumatische pomp. Vul de micropipette met het geïnjecteerde materiaal, in dit geval dextran-FITC met of zonder LPS. Maak een petrischaaltje bedekt met een strook transparante film. Plaats twee tot vier stippen van 1 μL geïnjecteerd materiaal op de film. Gebruik de micromanipulator om de punt van de micropipette naar net binnen de vloeistof te brengen, maar boven de film onder de visualisatie van een stereomicroscoop. Trek voorzichtig aan de spuit om het geïnjecteerde materiaal in de micropipette op te zuigen. Vul de micropipette met 2-4 μL geïnjecteerd materiaal en druk op de spuit om eventuele lucht aan de punt van de micropipette te verwijderen. Inspecteer de geïnjecteerde materiaalkolom in de micropipette om er zeker van te zijn dat er geen luchtzak is. Noteer het volume geïnjecteerd materiaal dat zich in de micropipette heeft teruggetrokken.OPMERKING: De vloeistof is zichtbaar in een groenachtige kleur als gevolg van dextran-FITC. Schakel de luchtbron in die is aangesloten op de pneumatische pomp, die een luchtdruk van ongeveer 60 psi levert. Schakel de pomp in en stel de pompduur in op 10-15 ms. Draai de stopkraan op de spuit om de lijn van de pomp naar de micropipette te openen.LET OP: Door de langere pompduur kan er meer materiaal per pomp vrijkomen. Het wordt aanbevolen om dezelfde pompduur en micropipettes met vergelijkbare tipgroottes te gebruiken voor het hele experiment voor schatting van het geïnjecteerde volume. Verwijder de enteroïden uit de celkweekincubator en plaats de schotels op een warmschuimsteen in een afgedekte container om de blootstelling aan licht na micro-injectie te beperken. Plaats de petrischaal met enteroïden onder de stereomicroscoop en beweeg de micromanipulatorknoppen om de punt van de micropipette in een hoek van ongeveer 35°-45° ten opzichte van het horizontale oppervlak te plaatsen (figuur 3). Dit vergt enige oefening vooraf. Visualiseer en breng de enteroïden in elke petrischaal onder de microscoop in kaart om een plan te maken voor het injecteren van ongeveer 3-5 bolvormige enteroïden per gerecht. Zodra de punt van de micropipette zich dicht bij het vloeibare oppervlak bevindt, kijkt u in de microscoop-oculairs om de punt naar de beoogde enteroïde te brengen. Prik de enteroid door met de micropipettepunt door de z-asknop te bewegen met een nauwkeurige langzame beweging. De enteroïde wand zal indrukken en terugspringen zodra de punt door het enteroïde oppervlak gaat, op welk moment de vooruitgang zou moeten stoppen. Tik met één voet op het pomppedaal en vul de enteroid met de groenachtige dextran-FITC-oplossing totdat deze iets is uitgerekt. Noteer het aantal pompen om het verpompte volume en de dextranconcentratie te berekenen. Trek de punt van de micropipette terug na het voltooien van de microinjectie en ga naar de volgende enteroïde. Met oefening kan het proces soepel verlopen.Als de punt breekt, vervang deze dan door een andere micropipette met een vergelijkbare tipgrootte. Trek voldoende volume geïnjecteerd materiaal voor alle enteroïden in dezelfde blootstellingsgroep en vervang de micropipette tussen geïnjecteerde materialen om kruisbesmetting te voorkomen. Plaats de geïnjecteerde enteroïde schaal onder afdekking om blootstelling aan licht te voorkomen. Dextran-FITC inzameling en metingVerwijder na de micro-injectieprocedure onmiddellijk de kweekmedia. Wassen met verse groeimedia 2x om eventuele resterende dextran-FITC te verwijderen. Voeg nieuwe media toe en noteer de tijd als tijd 0 na micro-injectie.OPMERKING: Mogelijk hebt u een tweede persoon nodig om deze stap uit te voeren zonder het micro-injectieproces te verstoren. Verzamel 200 μL kweekmedia in een ondoorzichtige microfugebuis van 0,5 ml en vervang vervolgens de verwijderde kweekmedia door hetzelfde volume verse groeimedia op 1 uur, 2 uur, 4 uur, 6 uur, 8 uur, 10 uur en 12 uur na micro-injecties.OPMERKING: Het tijdsinterval kan variëren afhankelijk van het experiment. Bij een basolaterale blootstelling moeten de vervangende media de blootstelling in dezelfde concentratie bevatten. Bewaar de verzamelde kweekmedia bij 4 °C en meet de dextranconcentratie binnen 24 uur. Bewaar overgebleven media bij −80 °C voor andere analyses. Aan het einde van de kweekmediaverzameling oogst u de enteroïden voor RNA-extractie of beeldvorming, indien nodig. Meet dextran-FITC-concentraties met een fluorescentiemicroplaatlezer. Construeer een standaardcurve voor elke plaat met behulp van seriële verdunningen en door een lineaire regressielijn aan te brengen zoals weergegeven in figuur 4. Corrigeer de absorptie voor het verwijderde volume van kweekmedia met dextran die werd vervangen door verse groeimedia zonder dextran als volgt: verwijdering van 200 μL uit 2 ml kweekmedia is 10 volumeprocent.Gecorrigeerde absorptie bij 2 h = (absorptie bij 1 h x 10%) + gemeten absorptie bij 2 hAbsorptie van het eerste gecorrigeerde medium hoeft niet te worden gecorrigeerd. Bereken vervolgens de dextranconcentratie op basis van de gecorrigeerde absorptiewaarde met behulp van de standaardcurvevergelijking. Deel voor normalisatie de dextranconcentratie door het totale aantal pompen voor elke petrischaal en vermenigvuldig vervolgens met het grootste totale aantal pompen per schotel.OPMERKING: Alle blootstellingen worden uitgevoerd in drievoud (drie petrischalen per blootstelling met 3-5 micro geïnjecteerde enteroïden per gerecht). De gemiddelde waarden van de drielicaten worden vergeleken tussen blootstellingen met behulp van de t-test van een student.