Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

1. C. elegans의 성장과 유지 쏟아지는 선충류 성장 배지 (NGM) 플레이트1 mM CaCl2, 5 μg/mL콜레스테롤, 25 mM KPO4 (pH 6.0), 1 mM MgSO4, 0.25% w/v 펩톤 및 51.3 mM NaCl로 구성된 선충류 성장 배지 (NGM)로 표준 2% 한천 플레이트 상에서 C. 엘레간을 성장시킨다. NGM-한천 플레이트 1L에 대해, 2.5g의 펩톤, 3.0g의 NaCl 및 20g의 한천을 교반 막대가 있는 1L 플라스크에 넣고 측정한다.참고 : 브랜드 간의 강성이 다양하여 재현성에 영향을 줄 수 있으므로 특정 한천 소스를 표준화하는 것이 좋습니다. 여기에서는 Bacto-Agar가 엄격하게 사용됩니다. 또한, 한천은 가열하지 않고 완전히 용해되지 않으며 한천을 함유 한 용액을 옮기면 한천이 손실되고 집중력이 떨어질 수 있으므로 오토클레이브 플라스크에 직접 한천을 첨가하는 것이 좋습니다. 최대 970mL의dH2O를 첨가한다.참고 : 멸균 후 30mL의 액체 첨가제는 최종 부피를 1L로 가져옵니다. 우리 손에는 최종 부피의 970 mL에 도달하기 위해 ~ 951 mL의dH2O가 필요할 것입니다. 효율적인 살균을 위해 표준 오토클레이브 또는 미디어 멸균기를 사용하여 NGM-한천 용액을 멸균하십시오.참고: 이 시점에서 멸균 NGM-한천은 실온에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다. NGM-한천을 보관하면 15-45 s 펄스의 전자 레인지에서 용액을 끓이거나 가열 된 수조에서 끓는 것을 방지 할 수 있습니다. 용액이 60-75°C로 냉각될 때까지 교반시킨다. 냉각하는 동안 교반하는 것은 고르지 않은 냉각을 방지하는 데 중요하며, 이로 인해 일부 한천이 응고될 수 있습니다. 용액이 냉각되는 동안, 수조 또는 비드 배쓰를 65-70°C로 가열한다. 용액이 60-75 °C로 냉각되면 0.5 M CaCl2 2.0 mL, 5 mg / mL 콜레스테롤 1mL, 1 M KPO4 (pH 6.0) 및 0.5 M MgSO4 (모든 시약에 대한 조리법은 표 1 참조) 등의 액체 첨가제를 첨가하고 용액이 ~ 5 분 동안 혼합되도록 허용하여 완전한 혼합을 보장합니다.참고: 약물은 여기에 플레이트에도 포함될 수 있습니다 (예 : 100 mg / mL 카베니실린 1 mL와 1 M IPTG 1 mL 추가, 2.5 mg / mL tunicamy신 10 mL 추가, 400 mM 파라콰트 10 mL 추가). NGM-한천을 함유하는 가라침 플라스크를 65-70°C 수조에서 플레이트에 붓는 동안 NGM-한천이 응고되는 것을 방지한다. 9-11 mL의 용액을 각 60 mm 플레이트에 넣거나 20-30 mL의 용액을 각 100 mm 플레이트에 넣습니다.참고: 피펫에서 팽창하는 공기로 인한 NGM 누출을 방지하기 위해 사용 가능한 가장 작은 피펫 볼륨을 사용하는 것이 좋습니다. 피펫을 완전히 비우는 것을 피하기 위해 각 플레이트에 첨가되는 것보다 1-2 mL 더 많은 배지를 피펫팅하면 기포 형성을 방지하는 데 도움이됩니다. 또는 플레이트를 병에서 직접 플레이트에 직접 부을 수 있지만 동일한 부피의 플레이트를 보장하기 위해 피펫팅을 적극 권장합니다. 동일한 부피의 플레이트는 용액이 플레이트 위에 직접 적용되는 방법을 사용할 때 유사한 농도의 솔루션을 보장하는 데 중요합니다 (1.1.17 단계 참조). 동일한 부피는 또한 쉽게 현미경을 통해 플레이트 전체에 걸쳐 유사한 초점 평면을 유지할 수 있습니다. 온도를 유지하고 NGM-아가가 응고되는 것을 방지하기 위해 가열된 용액에 피펫을 다시 넣으십시오. 모든 플레이트에 대해 위의 두 단계를 반복합니다. NGM-한천 플레이트가 하룻밤 사이에 응고되도록 허용하십시오. 플레이트가 응고된 후, 플레이트를 4°C에서 최대 3개월 동안 저장하거나 박테리아로 플레이트를 시딩하기 위한 단계 1.1.14로 이동시킨다. 플레이트를 밀봉된 용기에 보관하여 습기를 유지하여 플레이트 품질을 유지합니다. OP50의 배양물을 주위 온도 (~ 22-25 °C)에서 24-48 시간 동안 리조제니 브로스 (LB) 또는 동등한 배지에서 성장시키거나 LB + 항생제 (암피실린 / 탄수화물 + 테트라 사이클린은 HT115에 권장됨)에서 HT115의 배양물을 37 °C에서 12-16 시간 동안 진탕하면서 성장시킨다.참고 : OP50의보다 공격적인 성장이 37 °C에서 발견되어 C. elegans 수명에 영향을 미치기 때문에 실온에서 OP50을 성장시키는 것이 좋습니다. 대조적으로, HT115는 성장 속도가 느리고 덜 조밀 한 배양물을 만듭니다. 따라서 HT115를 37 ° C에서 흔들면서 성장시키는 것이 좋습니다. 포화 OP50/HT115 배양물을 100-200 μL의 부피를 60 mm 플레이트 상에 시딩하거나, 100 mm 플레이트를 위해 1 mL를 시드한다. 접시를 벤치 탑에서 밤새 말리고 접시가 여전히 젖은 경우 건조하는 데 하루 더 허용하십시오. 플레이트를 밀봉 된 용기에 4 °C에서 ~ 2 개월 동안 보관하십시오. 선택 사항: 웜을 화학적으로 살균하기 위해 시딩된 NGM-한천 플레이트(예: 10mg/mL FUDR 용액 100μL)에 약물을 직접 첨가합니다. C. elegans 주식 유지시드된 NGM-한천 플레이트의 바닥에 적절하게 라벨을 붙입니다. 표준 해부 현미경에서 빛의 통과를 방해하지 않도록 플레이트 하단의 가장자리에 라벨을 붙입니다. 표준 해부 현미경을 사용하여 C. elegans pick에 선택한 박테리아를 스쿱합니다.참고: 이 프로토콜에서는 유리 파스퇴르 피펫 끝에 부착된 90%/10% 백금/이리듐 와이어로 구성된 픽이 사용되었습니다. 박테리아를 사용하여 10-20 개의 알, L1, L2 또는 L3 동물을 수집하고 새로 표지 된 NGM-한천 플레이트로 옮깁니다.참고 : 어린 동물을 수집하는 것이 가장 좋습니다. 저자의 경험에 비추어 볼 때, 표준 야생형 동물의 경우 10-20 개의 달걀 / 어린 동물을 움직이면 접시가 기아없이 15 ° C에서 자랄 수 있습니다. 번식력이 감소한 트랜스제닉 또는 돌연변이 동물의 경우, 더 많은 동물을 플레이트로 옮겨야합니다. 야생형 번식력을 가진 동물의 경우 15°C에서 성장하고, 매주 스톡을 유지하기 위해 7일마다 1.2.1-1.2.3 단계를 반복한다. 20°C에서 자란 동물의 경우, 기아를 방지하기 위해 4-5일마다 1.2.1-1.2.3단계를 반복한다. 웜 동기화 via 표백참고: 전체 60 mm NGM-한천 플레이트 (예를 들어, 15°C에서 성장한 1주령 스톡 플레이트)는 기술된 대부분의 표준 검정을 위해 충분한 수의 동물을 제공할 것이다. 일반적으로 한 마리의 gravid 성인 (계란으로 가득 찬 성인)은 10-15 개의 알을 제공합니다.42, 그리고 전체 60mm NGM-한천 플레이트에는 100-200 명의 gravid 성인이 있으며 ~ 1000-2000 개의 알을 제공합니다.더 많은 동물이 필요한 대규모 실험의 경우, 전체 60mm NGM-한천을 네 개에서 여섯 개의 동일한 조각으로 자르고 확장을 위해 시드 된 100mm 플레이트에 덩어리로 묶습니다.참고 : 여기서 청크는 웜이 포함 된 NGM-agar 플레이트 조각을 자르고 한천 + 웜의 전체 덩어리를 새 플레이트로 옮기고 웜 사이드를 아래로 이동하여 웜이 새 플레이트로 기어 들어갈 수 있도록하는 것을 말합니다. 참고로, 야생형 번식력을 갖는 동물은 청크 후 2-3일 동안 20°C에서 성장하면 전체 100 mm 플레이트를 생성할 것이다. 선충류를 수집하기 시작하려면 소량의 M9 용액 (표 1)을 웜이 들어있는 접시에 붓고 페트리 접시를 과도하게 채우지 않도록주의하십시오. M9 용액을 부드럽게 소용돌이 치며 박테리아 잔디밭에서 웜을 풀어냅니다. 혈청 학적 피펫으로 gravid 성인 웜을 수집하고, 피펫 팁으로 한천을 관통하지 않도록주의하십시오.참고 : 유리 혈청 학적 피펫은 C. elegans 가 플라스틱에 달라 붙는 경향이 있으므로 권장됩니다. 유리 피펫을 사용할 수없는 경우 플라스틱 피펫에 달라 붙기 때문에 일부는 손실되므로 필요한 것보다 더 많은 수의 동물로 시작하는 것이 좋습니다. 동물을 1,100 x g에서 30 s 동안 원심분리하여 펠릿화한다. 상층액을 흡인하십시오.참고 : C. elegans 펠렛은 매우 느슨하므로 상층액을 흡인하는 동안 펠렛을 흔들거나 방해하지 않도록주의하십시오. 동물들이 원심분리하는 동안, 균주 당 5mL의 표백 용액을 준비하십시오 (조리법 세부사항은 표 1 참조); 용액 5 mL에 대해 1.5 mL의 6% 차아염소산나트륨(표백제), 0.75 mL의 5 M NaOH 또는 KOH, 및 2.75 mL의dH2O를혼합한다.주의: 차아염소산나트륨과 고농도 수산화 용액은 부식성이 있으므로 취급 시 장갑과 실험실 코트를 착용하는 것이 좋습니다. 웜 펠릿/M9 혼합물에 표백 용액 5mL를 첨가합니다. 모든 성인 웜 몸체가 용해되고 계란 만 혼합물에 남을 때까지 몇 분마다 해부 현미경으로 웜을 확인하십시오. 웜 / 표백제 믹스를 격렬하게 흔들어 표백 과정을 가속화하십시오.참고 : 표백제 믹스 안에 알을 장기간 방치하면 알이 손상되고 동물의 생존력에 영향을 미칩니다. 야생형 동물의 경우, 표백은 보통 흔들림으로 4-6 분이 걸립니다. 따라서 4 분 표시부터 시작하여 30 초 간격으로 현미경으로 동물을 확인하는 것이 좋습니다. 계란 / 표백제 믹스를 1,100 x g에서 30 초 동안 회전시켜 달걀을 펠릿화 하십시오.참고: 일부 15mL 코니컬 튜브에는 튜브 내부에 그라디언트 라인이 있습니다. 이 튜브의 경우, 계란이 튜브의 바닥에 펠릿을 내고 그라디언트 라인에 남아 있지 않도록 더 빠른 속도 (예 : 2,000 x g에서 30 초)로 계란을 회전시키는 것이 좋습니다. 표백 용액을 흡인하십시오.참고 : 달걀 펠릿은 웜 펠릿보다 뻣뻣하지만 여전히 쉽게 파괴 될 수 있습니다. 따라서 원심 분리 후 튜브를 흔들지 않도록주의하십시오. M9 용액을 최대 15mL까지 첨가하고 튜브를 네 번 또는 다섯 번 뒤집어 계란이 M9 용액에 완전히 분산되도록하여 계란을 씻으십시오. 펠릿 알을 1,100 x g 에서 30 초 동안 원심분리하여 M9 용액을 흡인한다. 계란 믹스에서 표백제를 제거하기 위해 총 네 번의 세척에 대해 위의 두 단계를 반복하십시오. 최종 세척 후 난자를 100 μL의 M9 용액 2 mL에 재현탁시킨다 (즉, 표백된 웜의 총 수에 따라). 덩어리를 부수고 펠렛이 완전히 재현탁되었는지 확인하기 위해 계란을 완전히 흔든다. 대안적으로, 동물은 보다 엄격한 시간적 동기화를 위해 L1 체포될 수 있고; L1 포획을 위해, M9 용액을 15 mL 코니컬 튜브에서 ~10 mL의 달걀 펠릿에 첨가한다. 웜을 회전기에서 20°C 또는 주변 온도에서 최대 24시간 동안 회전시키십시오. L1 동물은 일반적으로 1.3.16 단계에서 설명한 알의 타이밍에 비해 성인기에 도달하는 데 반나절이 덜 걸립니다. 4μL의 난자/M9 혼합물을 박테리아가 뿌려진 NGM 플레이트에 피펫팅하여 계란 농도(또는 L1 농도; 단계 1.3.14 참조)를 근사화합니다. 도금 된 μL 당 얼마나 많은 계란이 존재하는지 계산하고 계산하십시오. 계수를 서너 번 반복하여 근사치를 향상시킵니다.참고 : 계란 농도를 근사화하면 오버플레이팅없이 실험에 적합한 샘플 크기에 충분한 동물이 도금되어 기아가 발생합니다. 근사치에 기초하여, 적절한 수의 알을 선택한 박테리아로 씨를 뿌린 NGM-한천 플레이트에 플레이트하십시오. OP50 플레이트의 경우, 60mm 플레이트에 최대 200마리의 동물을 플레이트에 장착하고 100mm 플레이트에 1,000마리의 동물을 플레이트에 플레이트에 플레이트합니다. HT115 플레이트의 경우, 60mm 플레이트에 최대 150마리의 동물을 플레이트에 플레이트하고 100mm 플레이트에 600마리의 동물을 플레이트에 플레이트합니다.참고 : 이들은 실험실 조건에 따라 대략적인 숫자이며 숫자는 박테리아 잔디의 두께에 따라 변경 될 수 있습니다. 15 °C에서 자란 계란은 성인 1 일째에 도달하는 데 ~ 5 일이 걸릴 것입니다 (알을 낳는 최대한, gravid 성인 단계에 도달하는 데 ~ 140 시간). 20 °C에서 자란 계란은 성인 1 일째에 도달하는 데 ~ 4 일이 걸릴 것입니다 (알을 낳는 최대한, gravid 성인 단계에 도달하는 데 ~ 96 시간). 25 °C에서 자란 계란은 성인 1 일째에 도달하는 데 ~ 3.5 일이 걸릴 것입니다 (알을 낳는 최대한, gravid 성인 단계에 도달하는 데 ~ 62 시간). C. elegans 개체군을 동기화하는 대체 방법으로 알을 낳습니다.표백 프로토콜이 실현 가능하지 않은 경우 (예 : 원심 분리기를 사용할 수 없음), C. elegans의 개체군을 동기화하는 대체 방법으로 알을 낳는 절차를 수행하십시오. 이 프로토콜은 노동 집약적이며 동물의 수확량이 줄어들 것이라는 점을 명심하십시오. 알을 낳기 위해 8-12 마리의 포도 성인을 선택한 박테리아가 뿌려진 표준 NGM-한천 접시에 놓고 접시에 놓인 동물의 정확한 수를 문서화하십시오.참고 : 알을 낳는 절차는 실험에 사용될 온도에서 수행되어야합니다. 동물이 4-8 시간 동안 알을 낳도록 허용하십시오.참고 : 동물이 접시에 남아있는 지속 시간은 필요할 때 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 더 적은 시간을 사용할 수있을 때 더 많은 수의 동물을 더 짧은 알을 낳는 기간 동안 접시에 놓을 수 있습니다. C. elegans는 일반적으로 야생형 번식력43을 가진 동물에 대해 대략 다섯 개의 알/h의 비율로 추정될 수 있는 파열로 알을 낳는다. 1.3.16 단계의 권장 사항을 따라 동물이 과도하게 도금되지 않도록하십시오. 접시에서 모든 성인 동물을 제거하십시오.참고 : 접시에 남아있는 모든 성인 동물은 계속해서 알을 낳을 것이므로 동기화되지 않은 개체군이 생깁니다. 계란을 ~ 5 일 동안 15 °C에서 또는 ~ 4 일 동안 20 °C에서 1 일째 성인기에 도달하게하십시오. 2. C. elegans의 수명 측정 표준 수명선택한 박테리아 100μL로 플레이트를 시딩하여 NGM-한천 플레이트를 준비합니다. 일관성을 위해 모든 반복실험에서 동일한 박테리아가 사용되는지 확인하십시오. 웜은 성인기의 알을 낳는 단계에서 매일 이동하기 때문에 수명 기간 동안 NGM-agar 플레이트의 5 ~ 일곱 세트를 시드하고 균주 당 두 개에서 네 개의 플레이트를 종결하여 동물을 성인기까지 성장시킵니다 (즉, 수명에 15 마리의 동물로 구성된 여덟 개의 플레이트를 사용하는 경우 조건 당 40-56 개의 플레이트를 뿌려야합니다). 접시를 보관하기 전에 밤새 말리십시오.참고 : 플레이트를 4 °C에서 보관하고 박테리아가 두꺼운 잔디밭을 만들어 이동 / 계산 수명을 어렵게 만드는 것을 방지하기 위해 필요한 수의 플레이트를 매일 냉장 보관에서 제거하는 것이 좋습니다. 웜을 도금하기 전에 플레이트가 예열되었는지 확인하십시오. 단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다. 10-15 일째 성인 동물을 각각 8-12 개의 접시에 옮깁니다. 표준 수명의 경우, 검열 사건 후 표본 크기가 100 미만으로 너무 멀리 떨어지지 않도록 ~120 마리의 동물로 시작하십시오 (예 : 15 마리의 동물 = 120 마리의 동물로 구성된 8 개의 판, 10 마리의 동물로 구성된 12 개의 판 = 120 마리의 동물).참고 : 현재의 경우 10-15 마리의 동물이 대부분의 조사자에게 관리 가능한 숫자이지만 20 마리의 동물로 구성된 여섯 개의 판이 소모품 비용을 줄일 수도 있습니다. 처음 7-8 일 동안 또는 자손이 더 이상 보이지 않을 때까지 1-2 일마다 성인 동물을 자손으로부터 멀리 옮깁니다.참고 : 동물을 이틀에 한 번씩 움직여 재료를 절약 할 수 있지만 자손이있는 성인 개체군의 오염을 방지하기 위해 계란 / 애벌레 동물이 성인과 함께 옮겨지지 않도록주의해야합니다. 이 연구에서 가장 간단한 방법은 알을 낳는 것이 최대인 1-3 일에서 매일 동물을 이동 한 다음 알을 낳는 것이 최소화 된 5-8 일 동안 격일로 움직이는 동물로 전환하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 성인이 매일 움직이고 계란 / 애벌레가 1 일 안에 성인이 될 수 없기 때문에 1-3 일 동안 계란 / 애벌레 동물의 이동을 막을 필요는 없습니다. 동물들이 자손 생산을 중단 한 후, 모든 동물이 죽었거나 검열 된 것으로 점수 매겨질 때까지 격일로 수명을 채점하십시오. 혼란을 피하고 동일한 동물을 이야기하기 위해 접시에서 모든 죽은 동물이나 검열 된 동물을 제거하십시오.참고 : 죽음은 픽으로 부드럽게 만졌을 때 움직임이 보이지 않는 동물로 점수가 매겨집니다. 검열은 포장되거나, 외음부 / 장 돌출부를 나타내거나, 건조되는 판의 측면으로 기어 올라가는 동물로 점수가 매겨집니다. FUDR을 사용한 화학적 살균을 통한 수명선택한 박테리아 100μL로 플레이트를 시딩하여 NGM-한천 플레이트를 준비합니다. 일관성을 위해 모든 반복실험에서 동일한 박테리아가 사용되는지 확인하십시오. 수명 실험을 위해 균주 당 8-12 플레이트를 시드하고, 균주 당 2 내지 네 개의 플레이트를 종자하여 동물을 성인기까지 성장시킨다. 접시를 하룻밤 사이에 말리십시오. 수명 분석에 사용될 8-12 플레이트를 위해 박테리아 잔디밭 중앙에 100 μL의 100 μL를 첨가하십시오. 동물이 성인이 될 수 있도록 FUDR없이 두 개에서 네 개의 플레이트를 스타터 플레이트로 남겨 두는 것을 잊지 마십시오. 접시를 하룻밤 사이에 말리십시오.주의: FUDR은 DNA 합성을 차단하므로 취급 시 장갑을 착용하는 것이 좋습니다. 단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다.참고 :이 동물들은 FUDR이 동물을 체포 / 사망하게 할 것이므로 FUDR이없는 접시에서 자랄 필요가 있습니다. 10-15 일째 성인 동물을 FUDR이 들어있는 8-12 개의 플레이트 위로 옮깁니다. 표준 수명의 경우, 검열 사건 후 표본 크기가 100 미만으로 너무 멀리 떨어지지 않도록 ~120 마리의 동물로 시작하십시오 (예 : 15 마리의 동물 = 120 마리의 동물로 구성된 8 개의 판, 10 마리의 동물로 구성된 12 개의 판 = 120 마리의 동물).참고 : 자손 형성을 완전히 피해야하는 경우 L4 단계에서 동물을 FUDR로 옮길 수도 있지만 동물을 너무 일찍 이동해서는 안되며 동물이 외음부 / 장 돌출 위험이 높아지고 검열이 증가하게됩니다. 모든 동물이 사망 또는 검열 된 것으로 점수가 매겨질 때까지 격일로 수명을 채점하십시오. 혼란을 피하고 동일한 동물을 이야기하기 위해 접시에서 모든 죽은 동물이나 검열 된 동물을 제거하십시오.참고 : FUDR 수명의 경우, 자손은 L1 단계에서 체포되어 결국 사망하므로 무시할 수 있습니다. 온도에 민감한 멸균 돌연변이체를 사용한 수명선택한 박테리아 100μL로 플레이트를 시딩하여 NGM-한천 플레이트를 준비합니다. 일관성을 위해 모든 반복실험에서 동일한 박테리아가 사용되는지 확인하십시오. 수명 실험을 위해 균주 당 8-12 플레이트를 시드하고, 균주 당 2-4 플레이트를 종자하여 동물을 성인기까지 성장시킨다. 접시를 하룻밤 사이에 말리십시오. 단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다. 동물이 멸균 상태인지 확인하기 위해 25 °C의 제한 온도에서 동물을 키우는 것을 잊지 마십시오. 10-15 일째 성인 동물을 각각 8-12 개의 접시에 옮깁니다. 표준 수명의 경우, 검열 사건 후 표본 크기가 100 미만으로 너무 멀리 떨어지지 않도록 ~120 마리의 동물로 시작하십시오 (예 : 15 마리의 동물 = 120 마리의 동물로 구성된 8 개의 판, 10 마리의 동물로 구성된 12 개의 판 = 120 마리의 동물). 모든 동물이 사망 또는 검열 된 것으로 점수가 매겨질 때까지 격일로 수명을 채점하십시오. 혼란을 피하고 동일한 동물을 이야기하기 위해 접시에서 모든 죽은 동물이나 검열 된 동물을 제거하십시오.참고: 수명이 짧은 균주를 처리할 때는 25°C의 수명이 훨씬 짧아서 동적 범위가 제한되므로 매일 수명을 점수화하는 것이 좋습니다. 저자의 경험에 따르면, 동물은 2 일째 후에 20 °C로 다시 이동 될 수 있으며, 20 °C에서 수명을 기록하는 것이 더 바람직하다면 동물은 멸균 상태를 유지합니다. 3. C. elegans의 건강 범위 측정 스래싱을 통한 운동 행동 측정단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다. 1 일째 성인 벌레의 작은 식민지를 해부 범위 아래의 NGM-한천 플레이트 위로 옮겨 M9 용액 10-20 μL로 옮깁니다. 10-15 마리의 동물을 관리 가능한 수의 동물로 간주하는 것이 좋습니다. 한 번에 하나의 웜에 초점을 맞추고, 표본이 오목한 형성에서 볼록한 형성으로 전환되는 횟수를 15 초 내에 계산하십시오. 핸드 카운터와 타이머를 사용하여 분석 기간 동안 웜에 초점을 맞출 수 있습니다.참고: 보다 철저하고 쉬운 분석을 위해 플레이트 비디오를 녹화할 수 있습니다. 예를 들어, 표준 현미경 접안 렌즈 부착물은 대부분의 스마트 폰 및 디지털 카메라 ($ 15- $ 30)에서 사용할 수 있으며 저렴한 비용으로 비디오 스래싱을 할 수있는 훌륭한 옵션입니다. 액체의 다른 웜에 대해 3.1.3 단계를 반복하여 10-15 개의 웜에 대한 총 운동률을 평균화하십시오. 표본 크기가 더 크려면 3.1.2-3.1.4단계를 반복합니다. 웜을 원하는 나이로 노화시킵니다. 단계 2.1-2.3에 기재된 수명 분석을 위한 유사한 방법이 웜을 노화시키기 위해 사용될 수 있다. 3.1.2-3.1.4단계를 반복하여 원하는 연령에서 스래싱을 분석합니다.참고: 3.1.2단계의 대체 방법은 플레이트의 웜 그룹에 ~30μL 이상의 M9 용액을 첨가하는 것입니다. 이렇게하면 웜을 수동으로 전송해야하는 시간을 절약 할 수 있지만 웜이 단일 플레이트에있는 위치의 무작위 기회로 인해 웜 그룹이 플레이트의 단일 지점에 남아있을 것이라는 보장은 없습니다. C. elegans의 번식력 (계란 수) 측정 단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다. 계란 수에 대한 분석은 L4 단계에서 시작하는데, 이는 성인 1 일 전 ~ 1 일 (15 °C에서 ~ 3 일 또는 L1 체포 후 20 °C에서 ~ 2 일). L4 웜을 선택한 박테리아가 뿌려진 별도의 NGM-한천 플레이트에 골라냅니다. ~ 10-15 마리의 동물을 번식력 분석에 사용하는 것이 좋습니다.참고 : 박테리아 잔디밭에서 계란 가시성을 향상시키기 위해 선택한 박테리아를 50 % (즉, 포화 배양물이 아닌)로 희석하는 것이 좋습니다. 동물을 20°C에서 하룻밤 동안 성장시키도록 허용한다. 새로 시드 된 플레이트 배치가 다음날 준비되었는지 확인하십시오. 성인기의 1 일째에, 성인 웜을 선택한 희석 된 박테리아가 뿌려진 신선한 NGM-한천 플레이트에 옮기십시오.참고 : 갓 뿌린 접시를 사용하거나 두꺼운 박테리아 잔디를 예방하기 위해 사용할 때까지 플레이트를 4 °C에 보관하는 것이 좋습니다. 각 NGM-한천 접시에 놓인 알의 총 수를 계산하십시오.참고 : 플레이트 스캔을 돕기 위해 플레이트의 뚜껑에 그리드를 그려서 계란을 채점하는 플레이트 아래에 놓을 수 있습니다. 그런 다음 플레이트를 그리드 라인을 따라 스캔하여 플레이트가 움직일 때 방향을 유지하고 계란의 재계산을 방지 할 수 있습니다. 3.2.4-3.2.5 단계를 7-8 일 동안 반복하거나 접시에 계란이 더 이상 보이지 않을 때까지 반복하십시오.참고 : 알을 낳는 비율이 높은 1-3 일 동안, 적어도 12 시간마다 동물을 옮기는 것이 좋으며 하루에 두 번 달걀 수를 분석하는 것이 좋습니다. 그러나 이것은 소모품의 작업량과 비용을 증가시키므로 움직이는 동물과 측정은 하루에 한 번으로 제한 될 수 있지만 모든 알과 부화 된 동물이 제대로 계산되도록주의해야합니다. 부화 한 동물은이 분석의 목적을 위해 알로 계산됩니다. C. elegans 자손의 새끼 크기 (발달) 측정단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다. 무리 크기에 대한 검정은 L4 단계에서 시작하는데, 이는 성인 1 일 전 ~ 1 일 (15 °C에서 ~ 3 일 또는 L1 체포 후 20 °C에서 ~ 2 일). L4 웜을 선택한 박테리아가 뿌려진 별도의 NGM-한천 플레이트에 골라냅니다. ~ 10-15 마리의 동물을 번식력 분석에 사용하는 것이 좋습니다. 동물을 20°C에서 하룻밤 동안 성장시키도록 허용한다. 새로 시드 된 플레이트 배치가 다음날 준비되었는지 확인하십시오. 성인기의 1 일째에, 성인 웜을 선택한 박테리아가 뿌려진 신선한 NGM-한천 접시에 옮기십시오. 매 12-24 시간 (하루 2x 또는 하루 1x)마다 성인 웜을 7-8 일 동안 또는 자손이 더 이상 보이지 않을 때까지 선택한 박테리아가 뿌려진 신선한 NGM-한천 접시에 옮깁니다. 계란을 함유하는 모든 플레이트를 20°C에서 유지한다. 3.3.5단계를 7-8일 동안 또는 자손이 더 이상 보이지 않을 때까지 반복한다. 계란을 함유하는 모든 플레이트를 20°C에서 유지한다.참고: 자손 플레이트는 또한 스코어링이 필요하기 전에 시간을 연장하기 위해 15°C에서 저장될 수 있다. 벌레를 옮긴 지 이틀 후, 판에 발달 된 자손을 세십시오. L4 단계 (즉, 20 °C에서 부화 후 2 일) 또는 그 이전에 발생하는 웜을 계산하여 F2 생성 (즉, 자손의 자손)이 결과를 혼란스럽게하지 않도록하십시오. 살아있는 모든 웜을 계산하십시오.계산되는 동안 플레이트에서 모든 웜을 제거하십시오. 부화 / 발달이 지연된 동물을 놓치지 않도록 다시 채점하기 전에 플레이트를 1-2 일 동안 추가로 유지하십시오. 수집 된 모든 달걀 낳기 접시에 대해 3.3.7 단계를 반복하십시오.참고 : 새끼 크기 분석은 한 실험에서 두 세트의 데이터를 수집하여 소모품의 인건비와 비용을 최소화하기 위해 계란 수 분석 (3.2 단계)과 함께 수행 할 수 있습니다. 이것은 또한 동일한 동물 내에서 새끼 크기와 계란 수를 직접 비교할 수있게합니다. 4. C. elegans의 스트레스 탄력성 측정 튜니카마이신을 이용한 응급실 스트레스 민감도 측정튜니카마이신을 함유한 플레이트(단계 1.1.7, 주 참조)를 100μL의 박테리아로 시딩하여 NGM-한천 플레이트를 준비한다.주의: 튀니카마이신을 취급할 때는 장갑을 착용해야 합니다. 일관성을 위해 모든 반복실험에서 동일한 박테리아가 사용되는지 확인하십시오. 종자 생존 분석을 위해 균주 당 8-12개의 튜니카마이신 플레이트를 시드하고, 균주 당 튜니카마이신이 없는 두 개 내지 네 개의 플레이트를 성인기까지 성장시킨다. 접시를 하룻밤 사이에 말리십시오. 단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다.참고 : 동물은 튜니카 마이신에서 체포 / 사망하기 때문에 성인기의 1 일째까지 tunicamycin이없는 접시에서 동물을 재배해야합니다. 10-15 일째 성인 동물을 각각 8-12 개의 접시에 옮깁니다. 표준 생존 분석의 경우, 검열 사건 후 샘플 크기가 100 미만으로 너무 멀리 떨어지지 않도록 하기 위해 ~120마리의 동물로 시작한다(예를 들어, 15마리의 동물 = 120마리의 동물로 구성된 8개의 플레이트; 10마리의 동물로 구성된 12개의 플레이트 = 120개의 동물).참고 : FUDR 분석과 마찬가지로 tunicamycin은 L1 동물의 사망 / 체포를 유발하므로 동물을 움직이지 않고 tunicamycin 생존 분석을 수행 할 수 있습니다. 그러나 DMSO 조절을 수행 할 때 자손은 DMSO 플레이트에서 발생하므로 동물을 매일 이동해야하거나 멸균 기술이 필요합니다 (수명 섹션 2에서 사용 된 것과 동일한 방법을 생존 분석에 사용할 수 있음). 생존 분석은 수명과 유사하게 점수가 매겨진다. 혼란을 피하고 동일한 동물을 이야기하기 위해 접시에서 모든 죽은 동물이나 검열 된 동물을 제거하십시오.참고 : 격일로 동물을 채점하는 것이 가능하지만 tunicamycin에서 사망이 빠르게 발생하기 때문에 매일 생존 검정을 채점하는 것이 좋습니다. 파라콰트를 이용한 미토콘드리아/산화 스트레스 민감도 측정파라콰트를 함유하는 플레이트를 시딩하여 NGM-한천 플레이트를 준비한다(단계 1.1.7 참조; 주) 100 μL의 박테리아가 선택되었다.주의: 장갑은 파라콰트를 취급할 때는 환경적으로 위험하므로 착용해야 합니다. 많은 연구 기관이 환경 위험에 대한 구체적인 폐기 지침을 요구하기 때문에 폐기 요구 사항에 대해서는 기관의 환경 보건 및 안전을 확인하십시오. 일관성을 위해 모든 반복실험에서 동일한 박테리아가 사용되는지 확인하십시오. 종자 생존 검정을 위해 균주 당 8-12 플레이트를 시드하고, 균주 당 파라콰트가 없는 두 개 내지 네 개의 플레이트를 성인기까지 동물을 성장시킨다. 접시를 하룻밤 사이에 말리십시오. 단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다.참고 : 성인기의 1 일째까지 파라콰트없이 접시에 동물을 키우는 것을 잊지 마십시오. 그러나 일부 동물은 파라콰트 플레이트에서 성인기까지 발전 할 수 있으므로 살균 기술을 수행하거나 성인을 자손으로부터 멀어지게해야합니다 (2.2-2.3 단계 참조). 10-15 일째 성인 동물을 각각 8-12 개의 접시에 옮깁니다. 표준 생존 분석의 경우, 검열 사건 후 샘플 크기가 100 미만으로 너무 멀리 떨어지지 않도록 하기 위해 ∼120마리의 동물로 시작한다(예를 들어, 15마리의 동물 = 120마리의 동물로 구성된 8개의 플레이트; 10마리의 동물로 구성된 12개의 플레이트 = 120개의 동물). 생존 분석은 수명과 유사하게 점수가 매겨진다. 혼란을 피하고 동일한 동물을 이야기하기 위해 접시에서 모든 죽은 동물이나 검열 된 동물을 제거하십시오.참고 : 격일로 동물을 채점하는 것이 가능하지만 파라콰트에서 사망이 빠르게 발생하기 때문에 매일 생존 검정을 채점하는 것이 좋습니다. 이것은 특히 25°C에서 성장한 glp-4(bn2) 동물을 사용할 때 죽음이 매우 빠르게 일어나기 때문에 더욱 그러하다. 고온을 이용한 열응력 민감도(열포용성) 측정단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다. NGM-아가 플레이트를 37°C로 예열하고, 동물을 플레이트 상으로 옮기기 전에 플레이트를 적어도 1시간 동안 37°C 인큐베이터에 위치시킨다. 10-15 일 1 마리의 성인 동물을 각각 네 개에서 여섯 개의 미리 데운 접시에 옮깁니다. 표준 열관용의 경우, ~60마리의 동물로 시작하라(예를 들어, 15마리의 동물로 구성된 4개의 플레이트 = 60마리의 동물; 10마리의 동물로 구성된 6개의 플레이트 = 60마리의 동물) 동물을 37°C 인큐베이터에 넣고 매 2시간마다 사망률을 점수화한다. 죽음은 픽으로 부드럽게 만졌을 때 움직임이 없는 동물로 정의됩니다. 혼란을 피하고 동일한 동물을 이야기하기 위해 접시에서 모든 죽은 동물이나 검열 된 동물을 제거하십시오. 스코어링하는 동안 주위 온도에서 장시간 방치된 플레이트는 열관용 결과를 변경하므로 가능한 한 최소한의 시간 동안 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 제거해야 합니다.참고 : 한천의 온도가 하나의 균주를 득점하는 데 걸리는 시간에 극적으로 변하지 않아야하므로 한 번에 하나의 변형 만 꺼내서 득점하는 것이 좋습니다. 중간 열관용은 일반적으로 7-9 h에서 달성된다; 따라서 7 h, 9 h 및 11 h에서 적절한 분석을 확인하십시오.참고 : 인큐베이터의 변동성, 플레이트의 두께 및 각 실험실의 기타 혼란스러운 요인으로 인해 1-5 시간을 건너 뛸 수 있지만 시간대를 건너 뛸 계획이라면 각 실험실에서 타이밍을주의 깊게 적정하는 것이 중요합니다. 열저항에 대한 전체 가이드는 참조 44 를 참조하십시오. 대안적으로, 37°C 대신 34°C에서 열관용 분석을 수행한다.참고 : 34 °C에서의 중간 열관용은 훨씬 나중에 (이 연구에서 10-14 시간) 발생하며, 이는 열관용 분석이 밤늦게 준비 될 수있게 해줍니다 (34 ° C 인큐베이터에 배치), 스코어링은 다음날 일찍 시작됩니다. 이는 37°C 열관용 분석에 필요한 전형적인 12시간 주기보다는 ~8시간의 연속 스코어링을 허용한다.