단일 분자 연구를 위한 이중 광학 핀셋 및 미세 유체 공학 사용
Summary
미세 유체 챔버를 통해 연구 된 시각적 단일 분자 생화학은 유리 배럴, 기밀 주사기, 튜브와 플로우 셀의 안정적인 연결 및 주사기와 튜브 사이에 스위칭 밸브를 배치하여 기포 제거를 사용하여 크게 촉진됩니다. 이 프로토콜은 DNA 거래 및 분자간 상호 작용의 시각화를 가능하게 하는 이중 광학 트랩을 설명합니다.
Abstract
시각 생화학은 벌크 단계 연구에서 발생하는 평균화에서 가려진 단일 효소 또는 효소 복합체의 확률적 특성을 관찰하기 위한 강력한 기술입니다. 시각화를 달성하기 위해 하나의 트랩이 고정되고 다른 트랩이 이동되는 이중 광학 핀셋이 도립 형광 현미경 스테이지에 위치한 다중 스트림 미세 유체 챔버의 한 채널에 초점을 맞춥니다. 광학 핀셋은 형광 표지 DNA의 단일 분자를 포획하고 유체가 챔버를 통과하여 갇힌 비드를 지나 DNA를 B-형태(최소 힘, 즉 0pN)로 늘리고 핵산이 검은색 배경에 흰색 끈으로 관찰됩니다. DNA 분자는 제어 된 방식으로 반응을 시작할 수 있도록 흐름에 수직 인 단계를 번역함으로써 한 흐름에서 다음 흐름으로 이동합니다. 성공을 달성하기 위해 광학적으로 투명한 채널이 있는 미세유체 장치는 주사기 펌프에 고정된 유리 주사기에 결합됩니다. 최적의 결과는 플로우 셀에 영구적으로 접착된 커넥터, 기계적으로 단단하고 내화학성이 있는 튜브, 층류를 방해하는 기포를 제거하는 스위칭 밸브에 연결된 튜브를 사용합니다.
Introduction
단일 분자 수준에서 실시간으로 단백질-DNA 상호 작용을 시각화하는 능력은 게놈 안정성에 대한 중요한 통찰력을 제공했습니다1,2. 한 번에 하나씩 단일 분자의 DNA로 작업하는 것 외에도 근처의 개별 분자 간의 거래를 볼 수있는 기능은 추가적인 통찰력을 제공합니다 3,4,5. 추가 DNA 분자를 조작하려면 추가 광학 트랩과 고품질의 다중 채널 미세 유체 유동 세포6가 모두 필요합니다.
둘 이상의 옵티컬 트랩을 생성하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있습니다. 여기에는 검류계 스캐닝 미러, 음향 광학 변조기 및 회절 광학이 포함되며, 이는 홀로그램 광학 핀셋 4,7,8,9를 생성합니다. 종종 스캐닝 미러와 음향 광학 변조기는 시분할하는 트랩을 생성합니다. 여기에 설명된 설정에서 단일 Nd:YAG 레이저의 빔이 편광으로 분할된 다음 검류계 레이저 스캐닝 미러가 모바일 트랩이라고 하는 위치를 제어합니다(그림 1)4. 트래핑 빔을 현미경 대물렌즈의 후면 조리개로 향하게 하는 미러와 필터의 위치를 용이하게 하기 위해 HeNe 레이저가 사용됩니다. 이렇게 하면 HeNe 빔이 육안으로 볼 수 있지만 적외선 빔은 볼 수 없으므로 전체 정렬이 더 쉬워집니다. HeNe 빔은 또한 거울 및 기타 구성 요소의 위치를 덜 스트레스로 만드는 작업에 더 안전합니다. 처음에 이 레이저의 빔 경로는 1064nm 빔과 분리되어 있지만 동일한 빔 경로로 도입된 다음 현미경 대물렌즈로 도입됩니다. 물리적 정렬이 이루어지면 HeNe 빔 위에 1064nm 빔을 배치하고 적외선 뷰어와 다양한 빔 이미징 도구를 사용하여 빔 위치와 품질을 시각화함으로써 용이해집니다. 그런 다음 빔 확장기가 도입되고 그 결과 확장된 적외선 빔이 대물렌즈의 후면 조리개에 정렬됩니다. 마지막으로 대물렌즈를 제거하고 λ/2 파장판을 사용하여 각 편광 빔의 전력을 동일하게 측정 및 조정합니다(그림 1C). 전력 측정은 목표가 반환되면 수행되며 일반적으로 53%의 전력 손실이 발생합니다. 그러나 초점면에 안정적인 고정 및 이동 광학 트랩을 형성하기에 충분한 전력이 있습니다(그림 1D).
DNA 트랜잭션을 이미지화하기 위해 미세유체 유동 세포는 높은 공간 및 시간 분해능으로 단일 분자 수준에서 제어된 측정을 허용하므로 중요한 역할을 합니다(그림 2). 미세유체라는 용어는 5-500 μm10,11 범위의 치수를 갖는 하나 이상의 채널에서 유체를 조작하는 능력을 의미한다. 스트림이라는 용어는 채널 내의 실제 유체를 의미하고 채널은 유체 스트림 또는 스트림이 이동하는 물리적 채널을 나타냅니다. 단일 채널 플로우 셀 설계에는 반응이 관찰되는 일반적인 물리적 채널이 있으며 일반적으로 하나의 유체 스트림만 존재합니다. 따라서 이러한 설계를 단일 스트림 유동 셀이라고 합니다. 대조적으로, 다중 스트림 유동 세포는 2개 이상의 진입 채널이 단일의 공통된 물리적 채널로 수렴하는 미세유체 장치로서 정의된다(도 2A). 공통 채널 내에서 개별 채널에서 시작된 유체 스트림은 서로 평행하게 흐르고 확산으로 인해 발생하는 최소한의 혼합만으로 분리된 상태로 유지됩니다(그림 2B). 대부분의 실험 설정에서 단일 펌프는 동일한 속도로 유체를 각 채널로 밀어 넣습니다. 대조적으로, 경계 조향이 사용되는 경우, 3 개 이상의 독립적으로 제어되는 펌프가 채널을 통해 유체를 밀어냅니다. 그러나 각 펌프는 다른 속도로 작동하지만 공통 채널의 순 유량은 일정합니다12. 이를 통해 펌프 속도를 변경하는 것만으로 메인 채널 구성 요소를 신속하게 교환 할 수 있습니다.
층류 외에도 또 다른 중요한 요소는 층류 유체 흐름 내의 포물선 속도 프로파일입니다. 가장 높은 유속은 하천 중앙에서 발생하고 가장 느린 유속은 표면 옆에서 발생합니다(그림 2C)13. 이 프로파일은 형광 DNA의 정확한 시각화와 정확한 단일 분자 분석을 위해 스트림에 고정된 비드에 부착된 DNA 분자를 완전히 늘리기 위해 고려되어야 합니다. 여기서 DNA는 B형으로 늘어나고 0pN의 힘으로 제자리에 고정됩니다. 이를 위해 광학 트랩 위치의 초점은 하단 커버슬립 표면에서 10-20μm 위치에 있어야 합니다(그림 2D). DNA 분자가 B형 이상으로 늘어나지 않도록 주의해야 효소 반응을 억제할 수 있습니다. 전형적인 완충액 조건 하에서, 1 μm = 3,000 bp의 DNA14. 또한 커버슬립에서 10-20μm 떨어진 곳에 DNA 복합체를 포획하여 표면에서 멀리 위치시켜 표면 상호작용을 최소화합니다.
많은 방법이 미세유체 장치 채널을 생성하기 위해 사용되었으며, 이들은 실험실에서 수행되거나 유동 세포가 상업적 공급원 6,15,16,17로부터 구입할 수 있다. 플로우 셀을 구성하는 데 사용되는 최적의 재료는 기계적으로 단단하고 광학적으로 투명하고 형광이 낮으며 유기 용매에 영향을 받지 않아야 합니다6. 종종 붕규산 플로트 유리 또는 용융 실리카는 광학 트래핑, 시각화 및 힘 감지에 적합한 연장된 시간 동안 안정적인 흐름 환경을 제공하는 데 사용됩니다. 이러한 물질은 또한 표면 습윤 및 기포 제거를 단순화하기 위해 비수성 용매(예: 분광 광도계 등급 메탄올)와 유동 셀을 청소하기 위한 변성제(예: 6M 구아니디늄 염산염) 또는 세제의 사용을 허용합니다. 마지막으로, 유동 셀에 유체를 도입하기 위해 사용되는 방법은 복잡한 진공 펌프 시스템으로부터 단일 주사기 펌프 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27에 이르기까지 다양하다. 여기에 설명된 접근 방식에서는 최대 10개의 주사기를 수용할 수 있는 주사기 펌프가 사용됩니다(그림 3A). 이는 단일 채널 플로우 셀 또는 여러 유입 채널이 있는 플로우 셀을 사용할 수 있는 유연성을 제공합니다. 여기에서는 3채널 플로우 셀이 사용되며 폴리-에테르-에테르-케톤(PEEK) 튜브를 사용하여 주사기 펌프에 고정된 주사기에 결합됩니다(그림 3A-C). 유체의 흐름은 4방향 전환 밸브에 의해 제어되므로 유동 셀에 기포가 유입되는 것을 최소화하는 역할을 합니다(그림 3A, D). 또한 뻣뻣한 유리 벽과 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 코팅 플런저가 있는 해밀턴 기밀 주사기는 원활한 흐름14,27을 얻는 데 필수적인 매우 부드러운 플런저 동작을 제공하므로 권장됩니다.
설명된 실험 시스템에서, 2 내지 5개의 입구 채널을 갖는 플로우 셀이 사용되었다. 입구 채널의 수는 수행되는 실험에 따라 결정됩니다. RecBCD 및 Hop2-Mnd1의 연구를 위해, 2개의 스트림 채널은충분했다 14,28. 헬리 카제의 경우, 효소는 DNA의 자유 단에 결합되어 마그네슘과 ATP를 함유 한 스트림으로 번역되어 전좌 및 풀림을 시작했습니다. Hop2-Mnd1의 경우, 광학적으로 포획된 DNA를 단백질 및 완충제 ±가 금속 이온을 함유하는 인접한 유체 스트림으로 번역하였다. 3채널 유동 세포를 사용하면 스트림 1에 DNA를 포획하고 DNA를 스트림 2로 번역하여 단백질 결합이 일어나도록 한 다음 ATP가 존재하는 스트림 3으로 이동하여 반응을 시작할 수 있습니다. 위의 변형은 채널 2에서 형광 태그 단백질을 사용하는 것인데, 이는 유체 스트림이 완전히 흰색이되고 DNA의 시각화를 배제합니다. 이 분자가 스트림 3으로 번역되면 반응이 시작될 때 단백질과 DNA가 모두 보입니다.
유체 흐름을 제어하기 위해 4방향 전환 밸브를 사용하는 것은 유동 셀의 기포를 제거하는 시스템의 중요한 구성 요소입니다. 기포는 예측할 수 없는 방식으로 수축 및 팽창하여 유속의 급격한 변화와 난류의 도입을 초래하기 때문에 안정적인 유체 흐름에 해롭습니다. 밸브가 주사기와 입구 튜브 사이에 위치하면 주사기를 교체할 때 밸브 위치를 전환하여 유로를 분리합니다. 새 주사기를 제자리에 놓으면 플런저를 수동으로 눌러 >6μL(밸브의 데드 볼륨)가 배출되어 기포가 거의 완전히 제거됩니다.
플로우 셀에 커넥터를 부착하는 것은 플로우 셀 사용에서 속도를 제한하는 단계인 경우가 많습니다. 우리는 두 가지 유형의 커넥터 사용, 즉 압입으로 알려진 탈착식 및 영구 커넥터 (나노 포트 어셈블리)의 사용을 설명합니다. 탈착식 커넥터는 플로우 셀에 간단하게 부착할 수 있으며 권장 PTFE 외에도 다양한 유형의 유연한 튜브를 이러한 커넥터로 테스트할 수 있습니다. 이는 더 비싼 유리 플로우 셀을 희생하지 않고 튜브와 커넥터를 테스트하는 빠르고 비용 효율적인 방법입니다. 대조적으로, 나노 포트 어셈블리는 영구적으로 부착되고 최대 1,000psi의 압력을 견디며 우리 손에서는 직경이 다른 PEEK 튜브로 사용이 제한됩니다. 이것은 PEEK 튜빙이 바람직하게 사용되기 때문에 단점이 아닙니다. 영구 어셈블리가 부착된 단일 유리 플로우 셀은 신중하게 사용하여 1년 이상 재사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
흐름 시스템의 신중한 조립은 실험 4,6의 성공적인 결과에 매우 중요합니다. 프로토콜의 가장 어려운 측면 중 하나는 커넥터를 유리 표면에 부착하는 것입니다. 이를 위해 우리는 압입 피팅 튜브 커넥터와 나노 포트 어셈블리의 두 가지 접근 방식을 사용합니다. 압입 커넥터는 유리에 쉽게 부착된 후 집게를 사용하여 PTFE 튜브를 미리 형성된 구멍으로 밀…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bianco 실험실의 연구는 NIH가 PRB에 GM100156 및 GM144414를 부여합니다.
Materials
| 100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
| 10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
| 1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
| 1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
| 63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
| Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
| Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
| Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
| Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
| C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
| C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
| Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
| Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
| Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
| GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
| Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
| Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
| Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
| Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
| Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
| Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
| Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
| Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
| Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
| Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
| Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
| Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
| Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
| Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
| Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
| Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
| PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
| PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
| Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
| Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
| Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
| Stage | Leica | ||
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
| Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
| Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
| Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
| Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
| Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
| Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |
Referenzen
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