ईवी लक्षण वर्णन उपकरण की नवीनतम पीढ़ी एक साथ कई मापदंडों में एकल ईवी विश्लेषण करने में सक्षम हैं। नैनो-फ्लो साइटोमेट्री लेबलिंग के बिना 45 एनएम से बड़े सभी जैविक कणों को मापता है और विभिन्न फ्लोरोसेंट लेबलिंग तकनीकों द्वारा उप-आबादी की विशिष्ट विशेषताओं की पहचान करता है।
एकल कण लक्षण वर्णन बाह्य पुटिकाओं में अनुसंधान के लिए तेजी से प्रासंगिक हो गया है, थोक विश्लेषण तकनीकों और पहली पीढ़ी के कण विश्लेषण से नैनो-फ्लो साइटोमेट्री (एनएफसीएम) जैसे व्यापक बहु-पैरामीटर माप तक प्रगति कर रहा है। एनएफसीएम फ्लो साइटोमेट्री का एक रूप है जो विशेष रूप से नैनो-कण विश्लेषण के लिए डिज़ाइन किए गए इंस्ट्रूमेंटेशन का उपयोग करता है, जिससे हजारों ईवी को धुंधला तकनीकों के उपयोग के साथ और बिना प्रति मिनट विशेषता दी जा सकती है। उच्च रिज़ॉल्यूशन साइड स्कैटर (एसएस) का पता लगाने से 45 एनएम से बड़े सभी जैविक कणों के लिए आकार और एकाग्रता निर्धारित करने की अनुमति मिलती है, जबकि एक साथ प्रतिदीप्ति (एफएल) का पता लगाने से लेबल मार्करों और रुचि के लक्ष्यों की उपस्थिति की पहचान होती है। लेबल की गई उप-आबादी को तब कणों / एमएल की मात्रात्मक इकाइयों में या साइड स्कैटर द्वारा पहचाने गए कुल कणों के प्रतिशत के रूप में वर्णित किया जा सकता है।
यहां, वातानुकूलित सेल कल्चर मीडिया (सीसीएम) से प्राप्त ईवी को एक लिपिड डाई दोनों के साथ लेबल किया जाता है, ताकि झिल्ली के साथ कणों की पहचान की जा सके, और सीडी 9, सीडी 63 और सीडी 81 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी सामान्य ईवी मार्करों के रूप में। तुलना सामग्री के माप, एक एकाग्रता मानक और सिलिका नैनोस्फीयर के आकार मानक, साथ ही लेबल नमूना सामग्री का विश्लेषण 1 मिनट के विश्लेषण में किया जाता है। सॉफ्टवेयर का उपयोग तब लेबलिंग से स्वतंत्र सभी कणों की एकाग्रता और आकार वितरण प्रोफ़ाइल को मापने के लिए किया जाता है, इससे पहले कि प्रत्येक लेबल के लिए सकारात्मक कणों का निर्धारण किया जाए।
एक साथ एसएस और एफएल डिटेक्शन का उपयोग कई अलग-अलग ईवी स्रोतों और लेबलिंग लक्ष्यों, बाहरी और आंतरिक दोनों के साथ लचीले ढंग से किया जा सकता है, जो व्यापक और मात्रात्मक तरीके से ईवी नमूनों का वर्णन करते हैं।
ईवी क्या हैं?
एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवी) कई सामान्य सेलुलर और ऊतक गतिविधियों के अभिन्न अंग सेल-व्युत्पन्न झिल्लीदार कणों की एक श्रृंखला के लिए सामूहिक शब्द हैं। वैज्ञानिक क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला पर उनके प्रभाव और उनकी संभावित नैदानिक प्रासंगिकता ने ईवी अनुसंधान और औद्योगिक हित में वृद्धि को प्रेरितकिया है। छोटे ईवी (एसईवी) अनुसंधान मुख्य रूप से एक्सोसोम, 40-100 एनएम कणों पर केंद्रित है जो परिपक्वता से पहले शुरुआती एंडोसोम में गठन शुरू करते हैं और प्लाज्मा झिल्ली में मल्टी-वेसिकुलर बॉडी (एमवीबी) के संलयन के माध्यम से रिलीज होते हैं, साथ ही माइक्रोवेसिकल्स, जो सीधे प्लाज्मा झिल्ली से 80-1,000 एनएम कणबनाते हैं। एक तीसरी ईवी आबादी एपोप्टोटिक निकाय हैं, कोशिका मृत्यु के दौरान 50-1,500 एनएम कण बनते हैं, जिसका अर्थ है कि अन्य ईवी के लिए उनका सापेक्ष अनुपात बहुत परिवर्तनशील हो सकताहै।
चूंकि ईवी विशेषताएं उनके सेल / मूल के ऊतक में होने वाले परिवर्तनों का प्रतिनिधित्व कर सकती हैं, इसलिए निदान में उनके उपयोग की संभावना है। विभिन्न ‘ओमिक्स’ विश्लेषणों ने कोशिका उत्पत्ति और रोग की स्थिति के मार्करों की पहचान करना शुरू कर दिया है, जो ईवी स्रोतों जैसे रक्त प्लाज्मा / सीरम, मूत्र, लार और सेरेब्रल स्पाइनल फ्लूइड (सीएसएफ) 4,5 का उपयोग करके रोगियों के गैर-इनवेसिव मूल्यांकन की अनुमति दे सकता है। इन ईवी से संबंधित नवाचारों के पीछे एक प्रेरणा शक्ति नई लक्षण वर्णन तकनीकें हैं जो पिछली सीमाओं को दूर करती हैं।
एकल ईवी लक्षण वर्णन की आवश्यकता और चुनौतियां
एकल ईवी लक्षण वर्णन ईवी आइसोलेट्स के सत्यापन और विवरण दोनों के लिए तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है, साथ ही ईवी-आधारित उपचारों और निदानकी प्रगति के लिए इन नैनोकणों की प्रमुख विशेषताओं को स्पष्ट करता है। ईवी स्रोत और इच्छित उपयोग के आधार पर, शुद्धता का विश्लेषण, जिसे अक्सर ईवी से गैर-ईवी कणों के अनुपात के रूप में या ईवी से मुक्त प्रोटीन के रूप में वर्णित किया जाता है, को कई एनालिटिक्स 7 से महत्वपूर्ण मात्रा में डेटा की आवश्यकता हो सकतीहै।
ईवी प्रकाशनों में कण गणना और आकार माप पहले नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग (एनटीए), प्रतिरोधक पल्स सेंसिंग (आरपीएस), और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) 2 पर बहुत अधिक निर्भर हैं। मानक एनटीए और आरपीएस में ईवी को गैर-ईवी कणों से अलग करने की क्षमता की कमी है और उनकी अपनी चेतावनी है जैसे कि धीमी थ्रूपुट8 और एनटीए 9,10,11 के साथ देखी गई पहचान की अनुपयुक्त निचली सीमा।
टेट्रास्पैनिन सीडी 9, सीडी 63, और सीडी 81 ऐतिहासिक रूप से ईवी अलगाव / तैयारी में ईवी की उपस्थिति के लिए महत्वपूर्ण पहचानकर्ता रहे हैं। आमतौर पर, सेल लाइसेट12 की तुलना में ईवी आइसोलेट्स में इन प्रोटीनों के संवर्धन को दिखाने के लिए पश्चिमी सोख्ता (डब्ल्यूबी) और डॉट ब्लॉटिंग तकनीकों का उपयोग किया जाता है। हालांकि, ईवी उप-आबादी और सेल, ऊतक या रोगी से संबंधित भिन्नता दोनों के भीतर प्रदर्शन के संबंध में इन विधियों की मात्रा की कमी और इन ईवी मार्करों की विविधता, उन्नत विश्लेषणात्मक तकनीकों को प्रोत्साहित करती है, जो भौतिक और फेनोटाइपिक लक्षण वर्णनको एकीकृत करती हैं।
नैनो-फ्लो साइटोमेट्री एक व्यापक ईवी विश्लेषण तकनीक के रूप में
सही ईवी सांद्रता का निर्धारण करने के लिए बरकरार कणों की पहचान और एक सार्वभौमिक मार्कर की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से जटिल कण आइसोलेट्स में, जिसमें संकल्प सभी ईवी का पता लगाने में सक्षम होता है, जबकि उन्हें गैर-ईवी कणों से अलग कियाजाता है।
नैनो-फ्लो साइटोमेट्री (एनएफसीएम) एक ऐसी तकनीक है जो कण उप-आबादी की पहचान करने के लिए फ्लोरोसेंट लेबलिंग और पहचान का उपयोग करते हुए 45-1,000 एनएम के बीच आकार के कणों के अनलेबल विश्लेषण की अनुमति देती है। पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री से एक महत्वपूर्ण अंतर नैनोपार्टिकल विश्लेषण के लिए समर्पित उपकरणों का उपयोग है, जो सबसे बड़े रिज़ॉल्यूशन15 की अनुमति देता है। ईवी विश्लेषण, जो छोटे कण विश्लेषण के लिए पारंपरिक प्रवाह इंस्ट्रूमेंटेशन का उपयोग करता है, में सुधार हो रहा है, लेकिन फिर भी <100 एनएम ईवी16,17 का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए संकल्प प्राप्त करने के लिए संघर्ष करता है। बीड-आधारित फ्लो साइटोमेट्री एक और अनुकूलन है जो अक्सर ईवी विश्लेषण के लिए नियोजित होता है, लेकिन यह एकल कण का पता लगाने की संभावना को हटा देता है और कैप्चर आधारित पूर्वाग्रहों का परिचय देताहै।
ईवी विश्लेषण के लिए साइड स्कैटर (एसएस) चैनल में ~ 45 एनएम की पहचान की कम सीमा से लाभान्वित, एनएफसीएम एसएस ट्रिगरिंग का उपयोग करता है। इसे ‘कण प्रथम’ विश्लेषण के रूप में माना जा सकता है क्योंकि इसका मतलब है कि घटनाओं को प्रतिदीप्ति तीव्रता के विश्लेषण से पहले एक निर्धारित सीमा को पार करते हुए एक एसएस संकेत प्रदान करना चाहिए। यह अवक्रमित झिल्ली और फ्लोरोफोरे एकत्रीकरण जैसे झूठे सकारात्मक को हटा देता है, और बरकरार ईवी15 पर विश्लेषण केंद्रित करता है। एसएस माप का उपयोग चार-मोडल सिलिका नैनोस्फीयर मानक19 की तुलना में व्यक्तिगत कणों को आकार देने के लिए भी किया जाता है। प्रतिदीप्ति माप दो और डिटेक्टरों पर लिया जाता है, जिससे ईवी उप-आबादी20 की पहचान करने के लिए कण एकाग्रता, आकार और मार्करों की उपस्थिति या रुचि के अन्य लक्ष्यों का वर्णन करने के लिए प्रत्येक कण के लिए तीन साथ-साथ माप की अनुमति मिलती है।
निम्नलिखित प्रयोग में, एसएस और फ्लोरोसेंट (एफएल) माप का उपयोग >45 एनएम कणों को मापने, झिल्ली सकारात्मक ईवी के उप-समूह को दिखाने और ईवी उप-आबादी पर सीडी 9, सीडी 63, सीडी 81 प्रस्तुति की पहचान करने के लिए किया जाता है। एसएस द्वारा मापे गए कुल कणों के हिस्से के रूप में इन उप-आबादी की एकाग्रता और उनके अनुपात दोनों का वर्णन किया गया है, जैसा कि उनके आकार प्रोफाइल हैं।
नमूना और अभिकर्मक विवरण
फ्लोरोसेंट लेबलिंग और बाद में एनएफसीएम विश्लेषण के प्रदर्शन के लिए अलग-अलग सेल लाइनों से दो ईवी आइसोलेट्स का चयन किया गया था। दोनों ईवी सेट पीबीएस में निलंबित कर दिए गए थे और <3 महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए थे, लेकिन अधिकांश अन्य स्थितियां आइसोलेट्स के बीच अलग थीं। सी 2 सी 12 माउस मायोब्लास्ट सेल लाइन कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के भ्रूण अग्रदूत का प्रतिनिधित्व करती है और 2 डी संस्कृति में उगाई गई थी, जो अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा ईवी अलगाव से पहले 72 घंटे से अधिक विकास माध्यम को कंडीशनिंग करती थी। एसडब्ल्यू 620 एक मानव बृहदान्त्र एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइन है और इसे एक अल्पविकसित बायोरिएक्टर में उगाया गया था, जो 7 सप्ताह में मीडिया को समृद्ध करता है, जिसमें ईवी अलगाव आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा आयोजित किया जाता है और सेफ्रोस सीएल -2 बी कॉलम से 7-9 अंश एक नमूने में संयुक्त होते हैं।
जबकि सीसीएम से अलग और केंद्रित ईवी काम करने के लिए सबसे आसान नमूना प्रकार हैं, एनएफसीएम अधिकांश ईवी आइसोलेट्स पर लागू होता है, जिसमें सीरम, प्लाज्मा, मूत्र और सीएसएफ जैसे बायोफ्लुइड शामिल हैं। ये नमूना विश्लेषण सभी कणों के एनएफसीएम एसएस का पता लगाने से लाभान्वित होते हैं, जिससे एनटीए, टीआरपीएस और अन्य कण विश्लेषणों के साथ पुष्टि करने की अनुमति मिलती है, जबकि मात्रात्मक शब्दों में फ्लोरोसेंटली लेबल ईवी उप-आबादी के साथ-साथ कुल का अनुपात भी वर्णन किया जाता है, मल्टीपैरामीटर कण विश्लेषण के निष्पक्ष दृष्टिकोण के लिए। कम संसाधित नमूनों का विश्लेषण भी संभव है, जैसे कि अनक्लेरिफाइड मूत्र और ईवी समृद्ध सीसीएम कम दूषित प्रोटीन की आवश्यकता की चेतावनी के साथ।
यहां उपयोग की जाने वाली झिल्ली डाई का उद्देश्य लिपिड बाइलेयर में एकीकृत करना है, जिसमें झिल्ली लोडिंग के लिए लिपोफिलिक मोइटी और प्लाज्मा झिल्ली25 में बने रहने के लिए एक हाइड्रोफिलिक डाई है। वर्तमान में कोई सही ईवी लेबलिंग डाई नहीं है और चुनते समय कई मानदंडों पर विचार किया जाना चाहिए, जिसमें ईवी की विशिष्टता, निर्धारण या परमेबिलाइजेशन के साथ उपयुक्तता और ईवी लेबलिंग26 की दक्षता शामिल है।
सतह उजागर एपिटोप्स के फ्लोरोसेंट संयुग्मित एंटीबॉडी लेबलिंग ईवी उप-आबादी की पहचान करने के लिए एक प्रभावी तरीका साबित हुआहै। प्रोटोकॉल अनुकूलन का एक प्रमुख पहलू आसपास के बफर को फ्लोरोसेंट अनबाउंड एंटीबॉडी28 से भरने की अनुमति देकर कम फ्लोरेसेंस कणों का पता लगाने में बाधा डाले बिना सभी उपलब्ध एपिटोप्स से जुड़ने के लिए लेबलिंग संतृप्ति बिंदु को पूरा करना है, और उससे अधिक नहीं है। इसके अतिरिक्त, एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए उजागर बाध्यकारी साइटों की उपलब्धता संभावित रूप से कई कारकों से प्रभावित होती है। ईवी की भंडारण स्थितियों को ईवी29 की एकाग्रता और आकार प्रोफाइल को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, जिसमें अवलोकन भी एंटीबॉडी लेबलिंग30 पर प्रभाव का संकेत देते हैं। सतही कोरोना प्रोटीन की उपस्थिति, प्रोटीन संशोधन, और अलगाव तकनीकों के प्रभाव भी कुछ मामलों में एंटीबॉडी लेबलिंग पर प्रभाव डाल सकते हैं। अंततः, जैसे-जैसे फ्लोरोसेंट लेबलिंग का उपयोग ईवी अध्ययनों के लिए अधिक प्रचलित हो जाता है, कई विश्लेषणात्मक तकनीकों के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन और अनुकूलन अधिक परिष्कृत हो जाएगा।
परिणामों की सटीकता बढ़ाने के लिए, कई नियंत्रण शामिल किए जा सकते हैं जैसे (1) पीबीएस + डाई नियंत्रण, कुछ रंगों में मिसेल या कुल गठन का आकलन करने के लिए, जो एनएफसीएम विश्लेषण में एसएस + कणों के रूप में दिखाई दे सकते हैं, (2) पीबीएस + एंटीबॉडी नियंत्रण, समुच्चय हो सकते हैं, हालांकि अक्सर एसएस का पता लगाने के लिए पर्याप्त प्रकाश बिखेरने के लिए पर्याप्त बड़े नहीं होते हैं, (3) ईवी नमूना + आईजीजी एंटीबॉडी नियंत्रण, फ्लो साइटोमेट्री में आम और किसी भी गैर-विशिष्ट बाइंडिंग की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है, (4) गैर-ईवी कण नमूना + एंटीबॉडी / डाई नियंत्रण – जटिल कण नमूनों में ईवी की पहचान करने की आवश्यकता होने पर विशेष रूप से महत्वपूर्ण, शुद्ध कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एलडीएल) कणों या ईवी क्षीण / एब्लेटेड नमूने जैसे नियंत्रण चयनात्मक लेबलिंग को मान्य करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य कर सकते हैं, (5) सकारात्मक नियंत्रण डिजाइन करना कठिन है लेकिन कोशिकाओं पर एंटीबॉडी का सत्यापन एक उपयोगी समावेश है।
ईवी पर टेट्रास्पैनिन की प्रस्तुति
इस प्रयोग के एंटीबॉडी और झिल्ली लेबलिंग मात्रात्मक डेटा के उच्च स्तर को प्रदर्शित करता है जिसे एनएफसीएम विश्लेषण द्वारा एक छोटी समय सीमा में प्राप्त किया जा सकता है। झिल्ली और / या प्रोटीन उपस्थिति के फेनोटाइपिक माप के साथ कण व्यास / एकाग्रता की प्रमुख भौतिक विशेषताओं का एक साथ माप कण अलगाव के भीतर उप-आबादी के उच्च स्तर के विवरण की ओर जाता है।
महत्वपूर्ण रूप से, इन दो ईवी नमूनों में तीन ‘कुंजी’ ईवी-संबंधित टेट्रास्पैनिन, सीडी 9, सीडी 63, सीडी 81 के अलग-अलग स्तरों की पहचान की गई थी। सीडी 9 को सी 2 सी 12 व्युत्पन्न ईवी और एसडब्ल्यू 620 दोनों के लिए ईवी के सबसे बड़े अनुपात पर प्रस्तुत किया गया था, जिसमें सीडी 81 और सीडी 63 क्रमशः दूसरे और सबसे कम प्रस्तुत प्रोटीन थे।
दो बहुत अलग सेल स्रोतों से ईवी के टेट्रास्पैनिन प्रोफाइल में यहां देखी गई कुछ समानताओं के बावजूद, सीडी 9, सीडी 63 और सीडी 81 के स्तर सेल लाइन और रोगी व्युत्पन्न ईवी31 के बीच बहुत भिन्न हो सकते हैं।
दो ईवी नमूनों के बीच सीडी 63 अभिव्यक्ति में अंतर विशेष रूप से ‘ईवी-नेस’ के प्रमुख पहचानकर्ताओं की चल रही चर्चा के लिए प्रासंगिक है। जबकि SW620 EV के केवल ~ 8% में CD63 की प्रस्तुति कुछ लोगों द्वारा अप्रत्याशित हो सकती है, CD63 को आकार या घनत्व32 द्वारा अलग किए गए विभिन्न प्रकार के EV के खराब पहचानकर्ता के रूप में सुझाया गया है, और टेट्रास्पैनिन नकारात्मक ईवी की पहचान की गई है, भले ही एक्सोसोम जैसे33 के रूप में वर्णित किया गया हो।
जटिल कण अलगाव के भीतर ईवी की पहचान
सेल लाइन और रोगी-व्युत्पन्न ईवी दोनों में ईवी टेट्रास्पैनिन प्रोफाइल की विविधता, ईवी के टेट्रास्पैनिन-आधारित कैप्चर पर निर्भरता के खिलाफ चेतावनी देती है और नए ईवी पहचान विधियों की भविष्य की आवश्यकता पर प्रकाशडालती है। विशिष्ट प्रोटीन से स्वतंत्र ईवी लेबलिंग समान आकार के गैर-ईवी कणों से ईवी की पहचान करने के लिए अत्यधिक फायदेमंद साबित हो सकती है यदि ईवी विशिष्टता बहुत अधिक साबित हो सकती है। यह बायोफ्लुइड ईवी आइसोलेट्स के लिए विशेष रूप से सच है क्योंकि यह सुझाव दिया गया है कि मानव रक्त प्लाज्मा में ईवी की एकाग्रता 1010 कणों / एमएल की सीमा में है जबकि लिपोप्रोटीन को 1016 प्रति एमएल14,34 पर मापा जाता है। ईवी संवर्धन पर भी, टेट्रास्पैनिन मार्करों और / या एलडीएल मार्कर एपीओबी के लिए कण सकारात्मकता की तुलना करने वाले अध्ययन ईवी35 की तुलना में प्लेटलेट मुक्त प्लाज्मा (पीएफपी) नमूनों में एलडीएल की ~ 50-100 गुना अधिक प्रचुरता का सुझाव देते हैं।
इस्तेमाल की जाने वाली अलगाव तकनीक बहुत कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (वीएलडीएल), मध्यवर्ती घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (आईडीएल), और एलडीएल36 जैसे सह-पृथक गैर-ईवी कणों की सीमा को बहुत प्रभावित करती है। ईवी से बंधे लिपोप्रोटीन सह-आइसोलेट्स का विवरण भी है, जो संभावित रूप से एक महत्वपूर्ण जैविक भूमिका निभाते हुए, ईवी शुद्ध नमूने प्राप्त करना एक चुनौतीपूर्ण लक्ष्यबनाता है।
इसलिए, यह तर्क दिया जा सकता है कि ईवी के शुद्ध लेकिन सीमित चयन के अलगाव को प्राप्त करने के बजाय, उन कणों के विवरण पर अधिक ध्यान दिया जाना चाहिए जो एक नमूना बनाते हैं। थोक में टेट्रास्पैनिन बहुतायत को मापकर कणों का व्यापक विवरण प्राप्त करना और कण गणना अलग-अलग ईवी सांद्रता को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए अपर्याप्त हो सकता है, विशेष रूप से बायोफ्लुइड स्रोतोंसे 36,37। एक टियर-आधारित दृष्टिकोण में उप-आबादी की पहचान करना, कुल कणों, ईवी और ईवी को कुछ प्रोटीन पेश करना, जैसा कि इस प्रयोग में दिखाया गया है, नैनोपार्टिकल लक्षण वर्णन के लिए एक मजबूत समाधान प्रदान कर सकता है। यह भविष्य के चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए डिजाइनके साथ ईवी-लोडिंग और माइटोकॉन्ड्रिया38 जैसे ल्यूमिनल कार्गो के साथ सीडी 63 + ईवी की पहचान से जुड़ी परियोजनाओं के लिए मामला रहा है।
ईवी एनालिटिक्स के प्रदर्शनों की सूची में एनएफसीएम
एनएफसीएम ईवी विश्लेषण की ताकत वह तरीका है जिससे डेटा सबसे आम ईवी विश्लेषणों की पुष्टि और निर्माण कर सकता है और भौतिक और फेनोटाइपिक डेटा सेटों के बीच पुल बना सकता है। हालांकि, यह सटीक लेबलिंग प्रोटोकॉल पर आधारित है जिसे अक्सर रंगों और एंटीबॉडी जैसे अद्वितीय लेबलिंग अभिकर्मकों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। सटीक विश्लेषण के लिए एक प्रमुख मानदंड गैर-फ्लोरोसेंट बफर में निलंबित कणों को लेबल करना है, जो या तो अतिरिक्त अनबाउंड फ्लोरोफोरे को हटाने या एपिटोप संतृप्ति से अधिक नहीं होने के लिए प्रोटोकॉल के शोधन पर निर्भर करता है।
तुलनात्मक अध्ययनों से पता चला है कि ईवी का एनएफसीएम साइजिंग टीआरपीएस और क्रायो-टीईएम के अनुरूप डेटा प्रदान करता है, तकनीकों को ईवी आकार विश्लेषण10,39 के लिए एनटीए की तुलना में अधिक सटीक बताया गया है। हालांकि, किसी भी ऑप्टिकल-आधारित विधि के साथ, ईवी के लिए देखे गए हेटेरोजेनिक ऑप्टिकल गुणों के प्रभाव और संदर्भ सामग्री और ईवी के ऑप्टिकल गुणों के बीच अंतर को डेटा10 की व्याख्या करते समय स्वीकार किया जाना चाहिए।
वेस्टर्न ब्लॉटिंग ईवीमार्कर40 की पहचान के माध्यम से ईवी संवर्धन को इंगित करने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका रहा है। लेकिन कणों पर ऐसे मार्करों की उपस्थिति को प्रदर्शित करने की इच्छा ने ईवी-आधारित प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण17 में प्रगति की है। हालांकि, मजबूत डेटा प्रदान करने के लिए आवश्यक संकल्प वर्तमान में बिखरे हुए और फ्लोरोसेंट लाइट 19 दोनों के संबंध में समर्पित इंस्ट्रूमेंटेशन के माध्यम से प्राप्त किएजाते हैं।
एनएफसीएम शुरू में साइड स्कैटर माप का उपयोग करके विशिष्ट मार्करों के अप्रासंगिक सभी कणों का वर्णन करने का एक निष्पक्ष दृष्टिकोण प्रदान करता है, एनटीए, आरपीएस और टीईएम1 की सबसे आम तकनीकों के साथ पुष्टि करने की अनुमति देता है, जबकि साथ ही मात्रात्मक तरीके से डब्ल्यूबी या एलिसा के समान फेनोटाइपिक माप जोड़ता है।
The authors have nothing to disclose.
हम सामग्री और विशेषज्ञता प्रदान करना जारी रखने के लिए ओवेन डेविस और निक पीक के समूहों को धन्यवाद देना चाहते हैं।
APC Anti-CD81 antibody (M38) | abcam | ab233259 | Anti-Human CD81 APC conjugated antibody |
APC Anti-CD9 antibody (EM-04) | Abcam | ab82392 | Anti-mouse CD9 APC conjugated antibody |
APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted | abcam | ab82389 | Anti-Human CD9 APC conjugated antibody |
APC anti-mouse CD63 antibody | biolegend | 143905 | Anti-Mouse CD63 APC conjugated antibody |
APC anti-mouse/rat CD81 antibody | biolegend | 104909 | Anti-Mouse CD81 APC conjugated antibody |
CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC | invitrogen Via Fisherscientific | A15712 | Anti-Human CD63 APC conjugated antibody |
Celline AD1000 bioreactor | Merck | Z688037-5EA | |
Cleaning solution | NanoFCM | 17159 | In house cleaning solution for nanoanalyser |
EVs from C2C12 | Gifted | Mouse line | |
EVs from SW620 | Gifted | Human line | |
Memglow – Fluorogenic Membrane Probe | Cytoskeleton | MG01 | non toxic cell membrane dye |
NanoAnalyzer | NanoFCM | nano-flow cytometer for measurement of single particles | |
PBS, pH 7.2 | Gibco Via Fisherscientific | 12549079 | Salt solution for dilution of samples and antibodies |
Snaplock Microtubes, 0.60mL | Axygen Via Fisherscientific | 11371944 | Tubes required to load sample into nanoanalyser |