Seccionamiento del hueso temporal humano de alta velocidad para la evaluación de la patología del oído medio asociada a COVID-19
Summary
Este artículo describe una técnica para la seccionamiento rápido del hueso temporal humano que utiliza una microsierra con cuchillas de diamante gemelas para generar rodajas delgadas para la descalcificación rápida y el análisis de la inmunohistoquímica del hueso temporal.
Abstract
El análisis histopatológico de las secciones del hueso temporal humano es una técnica fundamental para el estudio de la patología del oído interno y medio. Las secciones de hueso temporal se preparan mediante la extracción de hueso temporal postmortem, fijación, descalcificación, incrustación y tinción. Debido a la densidad del hueso temporal, la descalcificación es un proceso lento y que requiere muchos recursos; La preparación completa del tejido puede tomar de 9 a 10 meses en promedio. Esto ralentiza la investigación de la otopatología y dificulta los estudios sensibles al tiempo, como los relevantes para la pandemia de COVID-19. Este artículo describe una técnica para la preparación rápida y la descalcificación de las secciones del hueso temporal para acelerar el procesamiento de los tejidos.
Los huesos temporales se cosecharon post mortem utilizando técnicas estándar y se fijaron en formalina al 10%. Se utilizó una microsierra de precisión con cuchillas de diamante gemelas para cortar cada sección en tres secciones gruesas. Las secciones gruesas del hueso temporal se descalcificaron en solución descalcificante durante 7-10 días antes de incrustarse en parafina, se seccionaron en secciones delgadas (10 μm) con un criotoma y se montaron en portaobjetos sin carga. Las muestras de tejido se desparafinaron y rehidrataron para la tinción de anticuerpos (ACE2, TMPRSS2, Furin) y se tomaron imágenes. Esta técnica redujo el tiempo desde la cosecha hasta el análisis de tejidos de 9-10 meses a 10-14 días. La seccionamiento del hueso temporal de alta velocidad puede aumentar la velocidad de la investigación de la otopatología y reducir los recursos necesarios para la preparación de tejidos, al tiempo que facilita estudios sensibles al tiempo como los relacionados con COVID-19.
Introduction
La investigación del hueso temporal humano proporciona un recurso invaluable para estudiar la patología y la fisiopatología del oído interno y medio. Antes del siglo 19, poco se sabía con respecto a la enfermedad otológica 1,2,3. Para comprender mejor la enfermedad otológica y “rescatar la cirugía auditiva de las manos de los charlatanes”, Joseph Toynbee (1815-1866) desarrolló métodos para estudiar secciones histológicas del hueso temporal humano3. Este trabajo fue promovido por Adam Politzer (1835-1920) en Viena y otros en toda Europa durante el resto del siglo XIX, quien utilizó secciones de hueso temporal para describir la histopatología de muchas afecciones comunes que afectan el oído 2,3,4.
El primer laboratorio de hueso temporal humano en los Estados Unidos se abrió en 1927 en el Hospital Johns Hopkins, donde Stacy Guild (1890-1966) desarrolló métodos para la seccionamiento del hueso temporal 5,6. Los métodos desarrollados por Guild consistieron en un proceso de 9-10 meses que incluyó la cosecha postmortem, fijación, descalcificación en ácido nítrico, deshidratación en etanol, incrustación de celoidina, seccionamiento, tinción y montaje. Las modificaciones a esta técnica fueron hechas más tarde por Harold Schuknecht (1917-1996)7; sin embargo, los componentes básicos de este proceso permanecen esencialmente sin cambios.
Los importantes recursos necesarios para mantener un laboratorio de huesos temporales han presentado un desafío para la investigación de huesos temporales y probablemente han contribuido a su disminución de popularidad en los últimos 30 años 4,8. Una parte significativa de los recursos de laboratorio de hueso temporal debe dedicarse al proceso de 9-10 meses de preparación del hueso temporal. Uno de los pasos más lentos en la preparación es la descalcificación del hueso temporal, que es el hueso más denso del cuerpo humano. La descalcificación se realiza típicamente en ácido nítrico o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y toma semanas o meses mientras requiere el cambio frecuente de soluciones 7,9. Además, los estudios sensibles al tiempo del oído humano, como los relacionados con la pandemia de COVID-19, pueden verse obstaculizados por este lento proceso de preparación. Este artículo describe una técnica para la seccionamiento óseo temporal de alta velocidad que utiliza una microsierra de diamante para generar secciones gruesas que permiten una rápida descalcificación y análisis de tejidos dentro de los 10-14 días posteriores a la cosecha temporal de huesos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La investigación del hueso temporal humano es fundamental para estudiar la patología del oído interno y medio, pero sigue siendo un esfuerzo que requiere mucho tiempo y recursos. Este artículo describe una técnica que utiliza una microsierra de diamante para generar secciones gruesas de hueso temporal que se pueden descalcificar rápidamente antes de seccionar más, de modo que el tiempo desde la cosecha de tejido hasta el estudio se puede reducir de 9-10 meses a 10-14 días. Esta técnica puede reducir los recursos…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Mohamed Lehar por su ayuda con este proyecto. Este trabajo fue parcialmente apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (T32DC000027, NSA).
Materials
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet – 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
Referenzen
- Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
- Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).
- Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
- Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
- Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).
- Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
- Schuknecht, H. . Pathology of the Ear. , (1993).
- Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science–and art–of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
- Nager, G. T. . Pathology of the Ear and Temporal Bone. , (1993).
- . COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE) Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022)
- Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).
- Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
- Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology – Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
- Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
- Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113 (2021).
- McCall, A. A., et al. Extralabyrinthine manifestations of DFNA9. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).
- Wu, P. Z., O’Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
- Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
- Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).
