Chromosoomconformatie vastleggen over lengteschalen

1. Fixatie door crosslinking Formaldehydefixatie: uitgaande van cellen in monolaagLaat cellen zaaien in het juiste medium om 5 × 106 cellen per plaat van 150 mm te oogsten.OPMERKING: Gebruikers kunnen elke gewenste container kiezen die zorgt voor een optimale groei van elke zoogdiercellijn. Bovendien kunnen cellen worden geïsoleerd uit weefsel. Aspirateer het medium met een Pasteur pipet gekoppeld aan een vacuümval van 150 mm plaat, was 2x met ~10 ml HBSS. Bereid onmiddellijk voor crosslinking een 1% FA-crosslinkingoplossing in een buis van 50 ml door 22,5 ml HBSS en 625 μL 37% FA te combineren tot een uiteindelijke concentratie van 1%. Meng zachtjes door te schommelen.LET OP: Gebruik zuurkast; formaldehyde is giftig. Om de cellen te verknopen, giet 23,125 ml van de 1% FA-oplossing op elke plaat van 15 cm. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en schommel de platen voorzichtig met de hand om de 2 minuten. Voeg 1,25 ml 2,5 m glycine (128 mM final) toe en draai de plaat voorzichtig rond om de crosslinking-reactie te doven. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en blijf gedurende ten minste 15 minuten op ijs incuberen om crosslinking te stoppen. Schraap de cellen van de platen met een celschraper of rubberen politieagent. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 50 ml met een pipet. Centrifugeer bij 1.000 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant door aspiratie weg. Was de celpellet eenmaal met 10 ml Dulbecco’s fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS), met behulp van een pipet om te resuspenderen. Centrifugeer vervolgens bij 1.000 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Ga onmiddellijk verder met DSG-crosslinking.OPMERKING: Wees voorzichtig bij het wassen van de celpellet, omdat celpellets los kunnen zitten en cellen verloren kunnen gaan. Formaldehydefixatie: uitgaande van cellen in suspensieLaat cellen zaaien in het juiste medium om 5 × 106 cellen per vat te oogsten.OPMERKING: Gebruikers kunnen elke gewenste container kiezen die zorgt voor een optimale celgroei van elke zoogdiercellijn. Tel vlak voor de oogst de cellen en breng 5 × 106 cellen over naar een conische buis van 50 ml. Pelleteer de cellen voorzichtig door te centrifugeren op 300 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Bereid 1% FA crosslinking-oplossing door 1,25 ml 37% FA toe te voegen aan 45 ml HBSS en meng door de buis meerdere keren om te keren.OPMERKING: Voeg de volledige 1,25 ml FA toe zonder de hoeveelheid te splitsen.LET OP: Formaldehyde is zeer giftig. Resuspendeer de celpellet in de 46,25 ml 1% FA-crosslinkingoplossing die in de vorige stap is bereid door op en neer te pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende precies 10 minuten op rotator, rocker of door zachte handmatige inversie van de buis om de 1-2 min. Doof de crosslinking reactie door 2,5 ml 2,5 m glycine (128 mM finale) toe te voegen en meng goed door de buis om te keren. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens op ijs gedurende ten minste 15 minuten om volledig te stoppen met crosslinken. Centrifugeer bij kamertemperatuur om de verknoopte cellen gedurende 10 minuten op 1.000 × g te pelleteren en gooi het supernatant door aspiratie weg. Was de cellen eenmaal met 10 ml DPBS en centrifugeer vervolgens op 1.000 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant volledig weg met behulp van een pipet en ga onmiddellijk over tot DSG-crosslinking.OPMERKING: Wees voorzichtig bij het wassen van de celpellet, omdat celpellets los kunnen zitten en cellen verloren kunnen gaan. Crosslinking met disuccinimidylglutaraatResuspensieer de gepelletiseerde cellen in 9,9 ml DPBS voordat 100 μL van 300 mM DSG (3 mM final) wordt toegevoegd. Meng door inversie.LET OP: DSG is vochtgevoelig. Het is belangrijk om op de dag van crosslinking een verse voorraad van 300 mM DSG in DMSO voor te bereiden.LET OP: DSG in DMSO is zeer giftig. Kruis de cellen bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten op een rotator. Voeg 1,925 ml 2,5 m glycine (400 mM final) toe, keer om om te mengen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Centrifugeer de cellen bij 2.000 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.OPMERKING: Wees voorzichtig bij het verwijderen van het supernatant uit losse celpellets. Resuspendeer de pellet in 1 ml 0,05% runderserumalbumine (BSA)-DPBS en breng over in een buis van 1,7 ml.OPMERKING: De toevoeging van BSA kan helpen om het samenklonteren van cellen te verminderen. Centrifugeer de cellen bij 2.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant via de pipet.OPMERKING: Om te voorkomen dat u de pellet verliest, verwijdert u het supernatant snel en volledig. Vries de pellet in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C of ga onmiddellijk verder met de volgende stap. 2. Chromosoom conformatie capture Cellyse en chromatineverteringResuspendeer (pipet) de verknoopte cel aliquots (~5 × 106 cellen) in 1 ml ijskoude lysisbuffer (recept in aanvullende tabel S1) met 10 μL proteaseremmercocktail en breng over naar een douncehomogenisator gedurende een incubatietijd van 15 minuten op ijs.OPMERKING: Voeg proteaseremmers onmiddellijk voor gebruik toe aan de lysisbuffer. Beweeg stamper A langzaam 30 keer op en neer om de cellen op ijs te homogeniseren en incubeer op ijs gedurende 1 minuut om de cellen te laten afkoelen, voor nog eens 30 slagen. Breng het lysaat over in een microcentrifugebuis van 1,7 ml.OPMERKING: Houd de suspensie in beweging omdat er soms cellen in de pipetpunt blijven plakken. Centrifugeer de gelyseerde suspensie bij 2.500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en veeg of vortex de natte pellet om te resuspenderen. Verwijder zoveel mogelijk van het supernatant om een yoghurtachtige substantie te verkrijgen met minimale klonten. Resuspendeer de pellet in 500 μL ijskoude 1x restrictiebuffer (vanaf 10x; zie recept in aanvullende tabel S1) en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2.500 × g. Herhaal deze stap voor een tweede wasbeurt.OPMERKING: De pellet in 1x Restrictiebuffer is korreliger dan de vorige pellet in lysisbuffer. Resuspendeer de cellen in een eindvolume van 360 μL 1x restrictiebuffer door te pipetteren na toevoeging van ~ 340 μL aan het overdrachtsvolume van de pellet, afhankelijk van de celgrootte. Reserveer 18 μL van elk lysaat voor het testen van de chromatine-integriteit (CI). Bewaar de CI-monsters bij 4 °C. Voeg 38 μL 1% natriumdodecylsulfaat (SDS) toe aan elke Hi-C-buis (totaal volume van 380 μL) en meng voorzichtig door te pipetteren zonder bubbels te introduceren.LET OP: SDS is giftig. Incubeer de monsters bij 65 °C zonder te schudden gedurende precies 10 minuten om het chromatine te openen. Plaats de buisjes onmiddellijk op ijs en bereid het digestiemengsel voor met Triton X-100 om het VIB te doven zoals beschreven in tabel 1. Voeg 107 μL van het digestiemengsel toe aan de Hi-C-buis (487 μL totaal) om het chromatine ‘s nachts (~ 16 uur) bij 37 °C in een thermomixer met intervalschudden (bijv. 900 tpm, 30 s aan, 4 minuten uit) te verteren.OPMERKING: De toevoeging van Triton aan een eindconcentratie van 1% dient om het VIB te doven. Biotinylering van DNA-uiteindenBreng de monsters na een nachtgisting gedurende 20 minuten over naar 65 °C om de resterende endonuclease-activiteit te deactiveren. Bereid tijdens de incubatie een invulmastermix zoals aangegeven in tabel 2. Na incubatie plaatst u de monsters onmiddellijk op ijs. Zet voor elk monster een vergistingscontrole (DC) van 10 μL opzij en bewaar bij 4 °C. Verwijder de condensatie van het deksel met een pipet of door te draaien. Voeg aan elk monster 58 μL biotine vulmengsel (totaal monstervolume 535 μL) toe en pipetteer voorzichtig zonder bellen te vormen. Incubeer de monsters bij 23 °C gedurende 4 uur in een thermomixer (bijv. 900 rpm, 30 s aan, 4 min uit). Ligatie van proximale DNA-fragmentenBereid de ligatiemix zoals weergegeven in tabel 3 terwijl de biotine fill-in broedt. Voeg 665 μL van het ligatiemengsel toe aan elk monster (totaal monstervolume 1.200 μL). Meng voorzichtig door te pipetteren. Incubeer de monsters bij 16 °C gedurende 4 uur in een thermomixer met intervalschudden (bijv. 900 tpm, 30 s aan, 4 minuten uit). Bewaar deze monsters met covalent gebonden chromatine bij 4 °C gedurende enkele dagen. Omkering van crosslinkingBreng de volumes van de CI- en DC-monsters op 50 μL met 1x Tris Low EDTA (TLE; zie het recept in aanvullende tabel S1). Voeg 10 μL 10 mg/ml proteïnase K toe aan CI- en DC-monsters. Incubeer ‘s nachts bij 65 °C met intervalschudden (bijv. 900 tpm, 30 s aan, 4 minuten uit). U kunt ook een omkering van 30 minuten van crosslinking uitvoeren voor deze controles tijdens de DNA-zuivering van de Hi-C-monsters. Voeg aan elk Hi-C-monster 50 μL 10 mg/ml proteïnase K toe en incubeer bij 65 °C gedurende ten minste 2 uur met intervalschudden (bijv. 900 rpm, 30 s aan, 4 min uit). Voeg nog eens 50 μL 10 mg/ml proteïnase K toe aan elke Hi-C-buis (totaal monstervolume 1.300 μL) en ga verder met broeden bij 65 °C ‘s nachts. Bewaren bij 4 °C tot dna-zuivering.OPMERKING: Het opsplitsen van proteïnase K-incubaties zorgt voor een totale eiwitvertering. DNA-zuiveringLaat de buizen afkoelen van 65 °C tot kamertemperatuur. Breng elk monster over in een conische buis van 15 ml en voeg een 2,6 ml (2x volume) fenol: chloroform: isoamylalcohol toe aan elke buis.LET OP: Fenol:chloroform:isoamylalcohol is een zeer giftige irriterende stof en is mogelijk kankerverwekkend. Vortex elke buis gedurende 1 minuut en breng vervolgens de inhoud over in een fasevergrendelingsbuis van 15 ml. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten met maximale snelheid (1.500-3.500 × g) in een benchtopcentrifuge. Giet de waterige fase voorzichtig in een ultracentrifugebuis van 35 ml en voeg ultrapuur water toe aan een eindvolume van 1.250 μL.OPMERKING: Gebruik buizen om de beschikbare ultracentrifuge te monteren of splits in meerdere microcentrifugebuizen. Voeg een 1/10e volume (~ 125 μL) van 3 M natriumacetaat toe en meng goed door inversie. Voeg een 2,5x volume (~ 3,4 ml) ijskoude 100% ethanol toe aan elk monster, balanceer de buizen voor ultracentrifugatie door ijskoude 100% ethanol toe te voegen en meng goed door inversie. Incubeer de buizen op droogijs gedurende ~ 15 minuten (vermijd stolling). Centrifugeer de buizen bij 18.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C.OPMERKING: Voor schuine rotoren: markeer de buizen voor waar de pellet zich zal bevinden. Verwijder met een pipet het supernatant volledig van de niet-pelletzijde en gooi het weg.OPMERKING: Op dit punt moet de pellet zichtbaar worden en kan deze op de buis worden gemarkeerd, omdat deze mogelijk niet duidelijk zichtbaar is na het drogen in de volgende stap. Droog de monsters aan de lucht gedurende ongeveer 10 minuten of totdat ze zichtbaar droog zijn. Verzacht elke pellet in 450 μL 1x TLE door pipetteren of wervelen en breng over naar 0,5 ml centrifugaalfiltereenheid (CFU) met een moleculaire gewichtsafsnijding van 3 kDa. Centrifugeer de CFU op maximale snelheid gedurende 10 minuten en gooi de flowthrough weg. Was elke ultracentrifugebuis met nog eens 450 μL 1x TLE en breng over naar de CFU voor een nieuwe wasbeurt.OPMERKING: Het wassen van de CFU op deze manier beperkt DNA-verlies terwijl de zoutconcentratie wordt verminderd. Centrifugeer de CFU op maximale snelheid gedurende 10 minuten en gooi de flowthrough weg. Voeg 80 μL 1x TLE toe aan de kolom en draai de kolom om in een nieuwe verzamelbuis voordat u gedurende 2 minuten met maximale snelheid centrifugeert om een eindvolume van ~ 100 μL te verkrijgen. Voeg 1 μL RnaseA (1 mg/ml; 10-voudige verdunning van 10 mg/ml bouillon) toe aan elk monster en incubeer bij 37 °C op een warmteblok, in een waterbad of een thermomixer gedurende ten minste 30 minuten. Verwijder na de Rnase-behandeling de monsters van 37 °C en bewaar bij 4 °C tot de stap van de kwaliteitscontrole. Controle van de chromatinekwaliteit, enzymvertering en monsterligatieKoel de CI- en DC-monsters af tot kamertemperatuur na het omkeren van de crosslinks in stap 2.4.5. Breng vervolgens over op een voorgespoten fasevergrendelingsbuis van 2 ml.OPMERKING: Zorg ervoor dat het gehalte aan fasevergrendeling wordt gecentrifugeerd tot een pellet (maximale snelheid gedurende 2 minuten). Voeg 200 μL fenol:chloroform:isoamylalcohol toe en meng de monsters door gedurende 1 min te vortexen. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten op maximale snelheid. Breng de waterige fase van elk monster (~ 50 μL) over naar een nieuwe microfugebuis van 1,7 ml. Voeg 1 μL Rnase A (van 1 mg/ml) toe en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten. Laad de monsters op een 0,8% agarose gel zoals aanbevolen in tabel 4.OPMERKING: De verwachte resultaten van een kwaliteitscontrole zijn weergegeven in figuur 2. Kwantificeer het DNA door densitometrie van de gel of met behulp van Qubit of Nanodrop.OPMERKING: Nauwkeurige kwantificering zorgt voor het juiste invoervolume in het volgende deel van het protocol. Gebruik verschillende standaarden met een bekende grootheid om een standaardcurve te construeren. Tabel 1: Digestiereagentia. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 2: Biotine fill-in reagentia. *Merk op dat veranderende enzymen verschillende buffers en gebiotinyleerde dNTP’s kunnen vereisen. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 3: Ligatiemengselreagentia. Afkorting: BSA = runderserumalbumine. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 4: Gelbelastingsparameters voor kwaliteits- en grootteselectiebeoordeling. Klik hier om deze tabel te downloaden. Figuur 2: Agarose-gel met typische resultaten van de kwaliteitscontrole na de zuivering na de DNA-zuivering. (A) De CI-controle moet een band van DNA met een hoog molecuulgewicht aangeven. (B) De DC- en Hi-C-monsters vertonen een reeks DNA-grootten. Het Hi-C-monster, dat in grotere fragmenten is gecombineerd, moet een hoger molecuulgewicht hebben dan het DC. Het concentratiebereik van markers maakt het mogelijk om een standaardcurve te genereren. Merk op dat in dit voorbeeld het CI op een afzonderlijke gel is geladen, maar het wordt geadviseerd om alle monsters en besturingselementen samen te laden en uit te voeren. Afkortingen: CI = chromatine integriteit; DC = controle van de spijsvertering; Hi-C = nabijheid-ligated. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 3. Hi-C sequencing bibliotheekvoorbereiding Verwijdering van biotine uit niet-geliformeerde uiteindenBereid biotineverwijderingsreacties voor zoals weergegeven in tabel 5.OPMERKING: Meestal is 10 μg DNA voldoende, maar tot 30 μg kan worden gebruikt. Verdeel 2 x 65 μL aliquots van elke 130 μL reactie in twee PCR-buizen. Breng over op een thermocycler of PCR-machine en incubeer zoals beschreven in tabel 5.OPMERKING: Monsters kunnen hier worden opgeslagen bij 4 °C (dagen tot weken), -20 °C (lange termijn), of onmiddellijk worden overgedragen naar ultrasoonapparaat. SonicatiePool de monsterduplicaten van de biotineverwijderingsstap (130 μL totaal monstervolume) in een 130 μL sonicatorbuis voor ultrasoonapparaat. Soniceer de monsters met behulp van de parameters in tabel 6 om een nauwe smal verdeling onder 500 bp te bereiken.OPMERKING: Verschillende sonicatortypen kunnen worden gebruikt, maar voor een smalle fragmentverdeling (100-500 bp) kunnen sonicatorinstellingen optimalisatie vereisen. Maatselectie met magnetische kralenPipetteer het gesonificeerde DNA van de sonicatorbuis(en) in een 1,7 ml lage bindingsbuis. Breng elk monster op een totaal volume van 500 μL met 1x TLE. Probeer het volume zo dicht mogelijk bij 500 μL te krijgen, omdat de verhouding tussen monster en magnetisch kralenmengsel essentieel is voor de keuze van de grootte. Voeg 400 μL magnetische kralenmengsel toe aan elke buis om een verhouding van magnetische kralenmengsel tot het monstervolume van 0,8 te bereiken.OPMERKING: Onder deze omstandigheden vangen kralen DNA-fragmenten > 300 bp, wat de bovenste fractie zal zijn. Het supernatant zal fragmenten <300 bp bevatten, wat de Onderste Fractie zal zijn. Meng de buizen door vortexing en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een rotator. Voor deze en andere grootteselectieverhoudingen moet u ervoor zorgen dat het volledige volume van het monster goed mengt. Zoek naar de “grillige modus” die sommige rotors hebben, die goed werkt voor kleinere volumes. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een magnetische deeltjesscheider (MPS). Voeg tijdens het broeden 500 μL van het mengsel van magnetische kralen toe aan een verse 1,7 μL lage bindingsbuis voor elk monster.OPMERKING: Deze buizen worden gebruikt voor de volgende grootteselectie van de onderste fractie door een magnetische kralenmengsel-monsterverhouding van 1,1: 1 te genereren. Laat de buizen 5 min op de MPS zitten. Verwijder het supernatant uit de kralen en resuspendeer met 150 μL van het magnetische kralenmengsel.OPMERKING: Deze stap voorkomt verzadiging van de kralen met DNA door het aantal kralen te verhogen zonder het volume te verhogen. Breng het supernatant van stap 3.3.5 over naar de gelabelde buis die is voorbereid om de onderste fractie te selecteren (stap 3.3.8).OPMERKING: 150 μL magnetische kralenmengsel + 400 μL van 0,8x magnetisch kralenmengsel (550 μL totaal) gedeeld door 500 μL initieel monster = 1,1x magnetische kralenmengsel/monsterverhouding. Meng de lower fraction buizen door vortexing en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een rotator.OPMERKING: De kralen binden DNA-fragmenten >100 bp, wat resulteert in een uiteindelijke kraalgebonden fractie van 100-300 bp. Plaats de Lower Fraction tubes op de MPS gedurende 5 min (kamertemperatuur). Verwijder het supernatant en centrifugeer de buizen kort om het supernatant zoveel mogelijk verder te verwijderen. Was de kralen van beide fracties tweemaal met 200 μL 70% ethanol en win de kralen gedurende 5 minuten terug op de MPS. Na een snelle draai in een centrifuge, verwijder de ethanol volledig en droog de kralen op de MPS verder.LET OP: Droog tot de alcohol volledig is verdampt. De pellet moet eruit zien als pure chocolade zonder te kraken (kan ~ 10 minuten duren). Resuspendeer beide fracties in 50 μL 1x TLE buffer. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en tik of veeg om de minuut op de buisjes om het mengen en de elutie te stimuleren. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 5 minuten voor beide fracties. Bewaar het supernatant uit elk monster. Pipetteer het supernatant in een 1,7 ml lage bindingsbuis.OPMERKING: De monsters kunnen enkele dagen bij 4 °C of op lange termijn bij -20 °C worden bewaard. Voer een 2% agarose gel uit zoals in tabel 4 om de kwaliteit en kwantiteit van het monster te bepalen. Zie figuur 3 voor een voorbeeld van zo’n gel.OPMERKING: Als uit ervaring ultrasoonapparaat zeer reproduceerbaar is, kan men deze gel overslaan en onmiddellijk doorgaan met het beëindigen van de reparatie. Het wordt aanbevolen dat gebruikers de bovenste fracties vasthouden tot na titratie PCR. Suboptimale DNA-grootheden die veel PCR-amplificatie zouden vereisen, kunnen worden gered uit materiaal in de Bovenste Fractie. Kwantificeer de hoeveelheid DNA uit de gel direct na het genereren van een standaardcurve uit de bekende DNA-ladderinvoer of met behulp van een Qubit of Nanodrop. EindreparatieBereid de eindreparatiemix voor zoals in tabel 7 (hoeveelheid per gegeven reactie). Breng de resterende 46 μL geëlueerd DNA over van de onderste fractie naar PCR-buizen en voeg 24 μL van het voorbereide eindreparatiemengsel toe. Incubeer in een PCR-machine, zoals voorgesteld in tabel 7. Zodra het programma is voltooid, houdt u de monsters op 4 °C totdat u ze naar beneden trekt. Pull-down van gebiotinyleerde ligatieproducten met streptavidin gecoate kralenBepaal de hoeveelheid met streptavidin beklede kralen voor elke bibliotheek uit de gekwantificeerde grootteselectie (stap 3.3.19).OPMERKING: Deze streptavidin-gecoate kralen (10 mg / ml oplossing) kunnen 20 μg dubbelstrengs DNA per mg kralen binden (= 20 μg / 100 μL kralen). Gebruik 2 μL voor elke 1 μg Hi-C DNA maar niet minder dan 10 μL. Meng de met streptavidin gecoate kralen en pipetteer het volume kralen dat nodig is voor elke bibliotheek (berekend in de vorige stap) in afzonderlijke 1,7 ml lage bindingsbuizen. Resuspenseer de kralen in 400 μL Tween wasbuffer (TWB; zie recept in aanvullende tabel S1) en incubeer gedurende ~3 minuten bij kamertemperatuur op een rotator (zie instructies in stap 3.3.4). Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 1 min en verwijder het supernatant. Was de kralen door nog eens 400 μL TWB te pipetteren. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 1 min en verwijder het supernatant. Voeg 400 μL 2x Binding Buffer (BB) (recept in Aanvullende Tabel S1) toe aan de kralen en resuspend. Voeg daarnaast 330 μL 1x TLE en de oplossing van End-repair (uit stap 3.4.3) toe. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur tijdens het mengen op een rotator. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 1 min en verwijder het supernatant. Voeg 400 μL 1x BB toe aan de kralen en resuspendeer. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 1 min en verwijder het supernatant. Voeg 100 μL 1x TLE toe om de kralen te wassen. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 1 min en verwijder het supernatant. Voeg ten slotte 41 μL 1x TLE toe om de kralen te resuspenderen. A-tailingBereid het A-tailingmengsel zoals in tabel 8. Pipetteer de reacties in PCR-buizen en incubeer zoals in tabel 8. Plaats de PCR-buizen onmiddellijk na verwijdering uit de thermocycler op ijs en breng de inhoud over naar 1,7 ml lage bindingsbuizen. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 1 minuut en gooi het supernatant weg. Voeg 400 μL 1x ligatiebuffer toe, verdund uit 5x T4 DNA ligasebuffer met ultrapuur water. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 1 minuut en gooi het supernatant vervolgens weg. Voeg 1x ligatiebuffer toe aan een eindvolume van 40 μL. Gloeiadapter oligo’sBereid adapter oligovoorraden van 100 μM voor (tabel 9).OPMERKING: Bestel 250 nmolen HPLC-gezuiverde oligo’s. Annealiseer de adapters in PCR-buizen zoals beschreven in tabel 9. Gebruik een PCR thermocycler om de temperatuur bij 0,5 °C/s geleidelijk op te voeren tot 97,5 °C. Houd 2,5 °C op 97,5 °C. Gebruik een PCR-thermocycler om de temperatuur geleidelijk op te voeren met 0,1 °C/s gedurende 775 cycli (tot 20 °C). Houd de temperatuur op 4 °C tot verder gebruik. Voeg 83 μL 1x Gloeibuffer toe (recept in aanvullende tabel S1) om de adapters te verdunnen tot 15 μM. Bewaar de adapters bij -20 °C. Sequencing adapter ligatieBereid het ligatiemengsel van de adapter in een 1,7 ml lage bindingsbuis (tabel 10). Ligaat gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 1 minuut en gooi het supernatant weg. Voeg 400 μL TWB toe en pipetteer de kralen voorzichtig op en neer voordat ze gedurende 5 minuten op de rotator worden gebrouwen bij kamertemperatuur. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS en herhaal deze stap nogmaals. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS (~1 min), gooi het supernatant weg en voeg 200 μL 1x BB toe. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS (~1 min) en gooi het supernatant weg. Voeg 200 μL 1x pre-PCR Buffer (vanaf 10x; recept in Aanvullende Tabel S1) toe en breng over naar een nieuwe 1,7 ml lage bindingsbuis. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS (~1 min) en gooi het supernatant weg. Voeg 20 μL 1x pre-PCR Buffer toe en meng door te pipetteren. Bewaar de buisjes op ijs tijdens gebruik of bewaar bij 4 °C. Optimalisatie van het PCR-cyclusnummer door titratieStel 30 μL mastermixreacties per monster in zoals in tabel 11 (hoeveelheid per gegeven reactie). Voer het laagste aantal cycli uit en neem een aliquot van 5 μL. Voer extra 2-3 cycli uit op de resterende reactie voordat u de volgende aliquot van 5 μL inneemt. Herhaal dit om vier aliquots te verzamelen. Gebruik PCR-parameters uit tabel 11 voor elke aliquot. Voeg 5 μL water en 2 μL 6x kleurstof toe aan elk monster van 5 μL. Voer op een 2% agarose TBE-gel (recept in aanvullende tabel S1) met 25-150 ng laagmoleculaire gewichtsladder. Zie figuur 4 voor de verwachte resultaten.OPMERKING: Een optimaal aantal cycli voor de uiteindelijke pcr-versterking van de bibliotheek [stap 3.10] is het laagste aantal cycli om zichtbaar product op de gel te krijgen minus één cyclus. Definitieve bibliotheek PCR-versterkingStel reacties van 12 x 30 μL in om elke uiteindelijke bibliotheek te versterken voor sequencing zoals in tabel 11. Cyclus de PCR-reacties volgens tabel 11 na het bepalen van het aantal cycli na PCR-titratie (stap 3.9.3). Zodra de PCR is voltooid, verzamelt u de replicaatmonsters in een 1,7 ml laagbindende microfugebuis. Plaats de buizen op de MPS en breng het supernatant over naar een nieuwe 1,7 ml laagbindende microfugebuis. Resuspendeer de overgebleven streptavidin-gecoate kralen in 20 μL van 1x pre-PCR Buffer.OPMERKING: Deze sjabloon kan worden hergebruikt wanneer deze dagen tot weken bij 4 °C of langdurig bij -20 °C wordt bewaard. Primers verwijderen met magnetisch kralenmengselGebruik 1x TLE buffer (recept in aanvullende tabel S1) om het volume aan te passen van stap 3.10.4 tot precies 360 μL. Voeg aan elk monster 360 μL van het magnetische kralenmengsel toe en pipetteer op en neer om te mengen. Meng op een rotator de monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS bij kamertemperatuur (3-5 min). Was de kralen twee keer met 200 μL 70% ethanol en win de kralen telkens 5 minuten terug op de MPS. Snel spin in een centrifuge en pipetteer de ethanol volledig af. Droog de kralen in lucht op de MPS om de ethanol verder te verdampen.OPMERKING: De pellet moet eruit zien als pure chocolade zonder te kraken (kan ~ 10 minuten duren). Voeg 30 μL ultrapuur water toe en resuspendeer om het DNA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te elueren. Veeg de buizen om de 2 minuten om te helpen mengen. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 5 minuten. Verzamel het supernatant van elk monster in een verse buis van 1,7 ml. Voer 1 μL van de bibliotheek uit op een 2% agarose TBE (recept in Supplemental Table S1) gel om een fragmentgrootteverdeling te verkrijgen en de uiteindelijke bibliotheek te kwantificeren (figuur 5).OPMERKING: ClaI-vertering kan alleen optreden voor DpnII-DpnII-juncties en dient als een positieve ligatiecontrole die zou moeten resulteren in een lagere fragmentgrootteverdeling voor de uiteindelijke bibliotheek. Definitieve bibliotheken kunnen enkele dagen worden bewaard bij 4 °C, langdurig bij -20 °C, of onmiddellijk worden verdund en voor sequencing worden ingediend. Tabel 5: Biotine verwijderingsreagentia en temperaturen Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 6: Parameters voor ultrasoonapparaat. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 7: Eindreparatiereagentia en temperaturen. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 8: A-tailing reagentia en temperaturen. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 9: PCR Primers en Paired-End-adapter oligo’s met reagentia die gloeien voor gloeien. Afkorting: 5PHOS = 5’ fosfaat. Sterretjes geven gefosforothioeerde DNA-basen aan. # Combineer een geïndexeerd oligo met het Universal oligo om te gloeien tot een geïndexeerde adapter. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 10: Ligatiereagentia van de adapter. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 11: PCR-reagentia en cyclusparameters. Klik hier om deze tabel te downloaden. Figuur 3: Agarose-gel met typische post-size selectieresultaten. De bovenste en onderste fracties voor vier monsters (genummerd 1-4) van DpnII-DdeI Hi-C worden weergegeven. De eerste baan voor elk monster bevat de bovenste fractie, afgeleid van een mengsel van 0,8x magnetische kralen, en de tweede en derde baan bevatten een verdunning van de onderste fractie afgeleid van een 1,1x magnetisch kralenmengsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Agarose gel met PCR titratie resultaten. Vanaf 5 cycli PCR worden monsters genomen na elke 2 cycli (5, 7, 9 en 11 cycli) voor elk van de vier bibliotheken. Op basis van dit cijfer werden 6 cycli gekozen als de optimale cyclus voor elk monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Definitieve PCR-producten. Na reiniging en maatselectie werden PCR-producten (Hi-C) geladen naast een ClaI-verteerde fractie van dezelfde bibliotheek (ClaI). ClaI-verteerde fragmenten wijzen op de aanwezigheid van gewilde DpnII-DpnII ligaties. Merk op dat ClaI geen DpnII-DdeI-juncties verteert en daarom zullen niet alle ligaties bijdragen aan een verkleining van deze beperking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.