לכידת קונפורמציה של כרומוזומים על פני סולמות אורך

1. קיבוע על ידי הצלבה קיבוע פורמלדהיד: החל מתאים במונולאיירזרעו תאים במדיום המתאים כדי לקצור 5 × 106 תאים לכל צלחת 150 מ”מ.הערה: משתמשים יכולים לבחור כל מיכל מועדף המבטיח צמיחה אופטימלית של כל קו תאי יונקים. בנוסף, ניתן לבודד תאים מרקמה. שאפו את המדיום עם פיפטה פסטר המצומדת למלכודת ואקום מצלחת 150 מ”מ, שטפו פי 2 עם ~ 10 מ”ל HBSS. מיד לפני ההצלבה, הכן תמיסת הצלבה של 1% FA בצינור של 50 מ”ל על ידי שילוב של 22.5 מ”ל של HBSS ו- 625 μL של 37% FA לריכוז סופי של 1%. מערבבים בעדינות על ידי נדנדה.התראה: יש להשתמש במכסה אדים; פורמלדהיד הוא רעיל. כדי להצליב את התאים, לשפוך 23.125 מ”ל של תמיסת FA 1% לכל צלחת 15 ס”מ. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ומנדנדים בעדינות את הצלחות ביד כל 2 דקות. הוסיפו 1.25 מ”ל של 2.5 מ’ גליצין (128 מ”מ סופי) וסובבו בעדינות את הצלחת כדי להרוות את תגובת ההצלבה. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ולהמשיך את הדגירה על הקרח למשך 15 דקות לפחות כדי להפסיק את ההצלבה. מגרדים את התאים מהצלחות בעזרת מגרד תאים או שוטר גומי. העבר את ההשעיה התא לצינור חרוטי של 50 מ”ל עם פיפט. צנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הסופר-נטנט על ידי שאיפה. שטפו את כדור התא פעם אחת עם 10 מ”ל של תמיסת מלח (DPBS) של דולבקו, תוך שימוש בפיפט להחייאה. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1,000 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. המשך מיד לקישור צולב של DSG.הערה: היזהר בעת שטיפת כדור התא מכיוון שכדורי התא עלולים להיות רופפים, ותאים עלולים ללכת לאיבוד. קיבוע פורמלדהיד: החל מתאים בהשעיהזרעו תאים במדיום מתאים כדי לקצור 5 × 106 תאים לכל כלי.הערה: משתמשים יכולים לבחור כל מיכל מועדף המבטיח צמיחת תאים אופטימלית של כל קו תאי יונקים. מיד לפני הקציר, לספור את התאים ולהעביר 5 × 106 תאים לצינור חרוטי 50 מ”ל. גלול בעדינות את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הכן תמיסת הצלבה של 1% FA על ידי הוספת 1.25 מ”ל של 37% FA ל-45 מ”ל של HBSS וערבב על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.הערה: הוסף את כל 1.25 מ”ל ה-FA מבלי לפצל את הסכום.אזהרה: פורמלדהיד הוא רעיל ביותר. השהה את גלולת התא בתמיסת ההצלבה של 46.25 מ”ל של 1% FA שהוכנה בשלב הקודם על ידי צנרת למעלה ולמטה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בדיוק על סיבוב, נדנדה, או על ידי היפוך ידני עדין של הצינור כל 1-2 דקות. הרוו את תגובת ההצלבה על ידי הוספת 2.5 מ”ל של 2.5 M גליצין (128 mM סופי) וערבבו היטב על ידי היפוך הצינור. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן על קרח לפחות 15 דקות כדי להפסיק crosslinking לחלוטין. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר כדי לזרוק את התאים הצולבים ב 1,000 × גרם במשך 10 דקות ולהשליך את supernatant על ידי שאיפה. שטפו את התאים פעם אחת עם 10 מ”ל של DPBS, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1,000 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את ה-supernatant לחלוטין באמצעות פיפט ולהמשיך מיד להצלבת DSG.הערה: היזהר בעת שטיפת כדור התא מכיוון שכדורי התא עלולים להיות רופפים, ותאים עלולים ללכת לאיבוד. הצלבה עם דיסוצ’ינימידיל גלוטראטהחזירו את התאים הכדוריים ב-9.9 מ”ל של DPBS לפני הוספת 100 מיקרולטר של 300 mM DSG (3 mM סופי). מערבבים לפי היפוך.הערה: DSG רגיש ללחות. חשוב להכין מלאי טרי של 300 mM DSG ב- DMSO ביום ההצלבה.אזהרה: DSG ב-DMSO הוא רעיל ביותר. קשר את התאים בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות על סיבוב. הוסיפו 1.925 מ”ל של 2.5 מ’ גליצין (400 מ”מ סופי), הפכו כדי לערבב ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. צנטריפוגה התאים ב 2,000 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.הערה: היזהר בעת הסרת הסופרנטנט מכדורי תאים רופפים. יש להשעות את הכדור ב-1 מ”ל של אלבומין בסרום בקר (BSA)-DPBS של 0.05% ולהעביר לצינור של 1.7 מ”ל.הערה: תוספת של BSA יכולה לעזור להפחית את התגבשות התאים. צנטריפוגה של התאים ב 2,000 × גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant על ידי פיפט.הערה: כדי למנוע אובדן של הכדור, הסר במהירות ובאופן מוחלט את הסופרנטנט. הצמד להקפיא את הכדור בחנקן נוזלי ולאחסן ב -80 °C או מיד להמשיך לשלב הבא. 2. לכידת קונפורמציה של כרומוזומים תזה של תאים ועיכול כרומטיןיש לתלות מחדש (פיפט) את האליקוטים של התאים המקושרים (~5 × 106 תאים ) ב-1 מ”ל של חיץ ליזיס קר כקרח (מתכון בטבלה משלימה S1) המכיל 10 μL של קוקטייל מעכבי פרוטאזות ולהעביר להומוגנייזר של דאנס למשך דגירה של 15 דקות על קרח.הערה: יש להוסיף מעכבי פרוטאז למאגר התזה מיד לפני השימוש. הזיזו באיטיות את מזיק A למעלה ולמטה 30 פעמים כדי ליצור הומוגניות של התאים על הקרח ולדגור על הקרח למשך דקה אחת כדי לאפשר לתאים להתקרר, לפני עוד 30 פעימות. מעבירים את הליזאט לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מ”ל.הערה: שמור על ההשעיה בתנועה מכיוון שלעתים תאים נדבקים בקצה הפיפטה. צנטריפוגה מתלה lysed ב 2,500 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופר-נטנט והזיזו או מערבלו את הכדור הרטוב כדי לבצע החייאה. הסר כמה שיותר מהסופרנטנט כדי להשיג חומר דמוי יוגורט עם מינימום גושים. יש להשעות את הכדור ב-500 מיקרו-ליטר של 1x Restriction Buffer קר כקרח (מ-10x; ראו מתכון בטבלה המשלימה S1) ולהשתמש בצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-2,500 × גרם. חזור על שלב זה לשטיפה שנייה.הערה: הכדור במאגר הגבלה 1x הוא גרגירי יותר מהכדור הקודם במאגר תזה. השהה את התאים בנפח סופי של 360 μL של 1x Restriction Buffer על ידי פיפטינג לאחר הוספת ~ 340 μL לנפח הנשיאה של הכדור, אשר תלוי בגודל התא. יש להפריש 18 μL מכל ליזאט לבדיקת תקינות הכרומטין (CI). אחסן את דגימות ה- CI ב- 4 °C. הוסיפו 38 μL של 1% נתרן דודציל סולפט (SDS) לכל צינור Hi-C (נפח כולל של 380 μL) וערבבו בזהירות על ידי פיפטינג מבלי להציג בועות.אזהרה: SDS הוא רעיל. דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד במשך 10 דקות בדיוק כדי לפתוח את הכרומטין. הניחו מיד את הצינורות על הקרח והכינו את תערובת העיכול עם Triton X-100 כדי להרוות את ה-SDS כמתואר בטבלה 1. הוסיפו 107 μL מתערובת העיכול לצינור Hi-C (487 μL סה”כ) כדי לעכל את הכרומטין למשך הלילה (~16 שעות) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתרמומיקסר עם רעידות מרווחים (למשל, 900 סל”ד, 30 שניות, 4 דקות הפסקה).הערה: התוספת של טריטון לריכוז סופי של 1% משמשת להרוות את ה- SDS. ביוטינילציה של קצוות הדנ”אלאחר עיכול בן לילה, העבירו את הדגימות ל-65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להשבית את פעילות האנדונוקלאז הנותרת. במהלך הדגירה, הכינו תערובת אב למילוי כפי שמוצג בטבלה 2. לאחר הדגירה, הניחו את הדגימות מיד על קרח. מניחים בצד בקרת עיכול (DC) של 10 μL לכל דגימה ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר את העיבוי מהמכסה עם פיפט או על ידי סיבוב. לכל דגימה, יש להוסיף 58 μL של תערובת מילוי ביוטין (נפח דגימה כולל 535 μL) ופיפט בעדינות מבלי ליצור בועות. דגירה של הדגימות ב-23 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות בתרמומיקסר (למשל, 900 סל”ד, 30 שניות, 4 דקות הפסקה). קשירת מקטעי דנ”א פרוקסימלייםהכינו את תערובת הקשירה כפי שמוצג בטבלה 3 בזמן שמילוי הביוטין נמצא בדגירה. הוסף 665 μL של תערובת הקשירה לכל דגימה (נפח דגימה כולל 1,200 μL). מערבבים בעדינות על ידי פיפטציה. דגירה של הדגימות ב-16°C למשך 4 שעות בתרמומיקסר עם רעידות מרווחים (למשל, 900 סל”ד, 30 שניות על, 4 דקות הפסקה). אחסן דגימות אלה המכילות כרומטין מקושר באופן קוולנטי ב-4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים. היפוך של הצלבההביאו את הנפחים של דגימות CI ו-DC ל-50 μL עם 1x Tris Low EDTA (TLE; ראו את המתכון בטבלה המשלימה S1). הוסף 10 μL של 10 מ”ג/מ”ל פרוטאינאז K לדגימות CI ו-DC. דגירה ב-65°C למשך הלילה עם רעידות מרווחים (למשל, 900 סל”ד, 30 שניות, 4 דקות הפסקה). לחלופין, בצע היפוך של 30 דקות של crosslinking עבור פקדים אלה במהלך טיהור DNA של דגימות Hi-C. לכל דגימת Hi-C, יש להוסיף 50 μL של 10 מ”ג/מ”ל פרוטאינאז K ולדגור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות עם רעידות מרווח (למשל, 900 סל”ד, 30 שניות, 4 דקות הפסקה). הוסיפו עוד 50 מיקרולטר של 10 מ”ג/מ”ל פרוטאינאז K לכל צינור Hi-C (נפח דגימה כולל 1,300 מיקרולטר) והמשיכו לדגור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לטיהור הדנ”א.הערה: פיצול הדגירה של Proteinase K מבטיח עיכול חלבון כולל. טיהור דנ”אמניחים לצינורות להתקרר מ-65°C עד לטמפרטורת החדר. מעבירים כל דגימה לצינור חרוטי של 15 מ”ל ומוסיפים 2.6 מ”ל (נפח פי 2) של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל לכל צינור.אזהרה: פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל הוא חומר מגרה רעיל מאוד ועלול להיות מסרטן. מערבלים כל צינור למשך דקה אחת ולאחר מכן מעבירים את תכולתו לצינור נעילת פאזה של 15 מ”ל. צנטריפוגה את הדגימות במשך 5 דקות במהירות מקסימלית (1,500-3,500 × גרם) בצנטריפוגה על ספסל. שפכו בזהירות את הפאזה המימית לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה של 35 מ”ל והוסיפו מים אולטרה-פוריים לנפח סופי של 1,250 מיקרו-ליטר.הערה: השתמש בצינורות כדי להתאים את האולטרה-צנטריפוגה הזמינה או התפצל למספר צינורות מיקרוצנטריפוגה. מוסיפים נפחשל 1/10 (~125 μL) של 3 M נתרן אצטט ומערבבים היטב על ידי היפוך. הוסף נפח של 2.5x (~ 3.4 מ”ל) של 100% אתנול קר כקרח לכל דגימה, אזן את הצינורות עבור ultracentrifugation על ידי הוספת 100% אתנול קר כקרח, וערבב היטב על ידי היפוך. לדגום את הצינורות על קרח יבש במשך ~ 15 דקות (למנוע התמצקות). צנטריפוגה הצינורות ב 18,000 × גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.הערה: עבור רוטורים זוויתיים: סמן את הצינורות עבור המקום שבו הכדור יהיה. בעזרת פיפטה, יש להסיר ולהשליך את הסופר-נטנט לחלוטין מהצד שאינו גלולה.הערה: בשלב זה, הכדור צריך להיות גלוי וניתן לסמן אותו על הצינור, מכיוון שהוא לא יכול להיות גלוי בבירור לאחר הייבוש בשלב הבא. יש לייבש באוויר את הדגימות במשך כ-10 דקות או עד שהן יבשות באופן נראה לעין. ניתן לבודד כל כדור בנפח של 450 μL של 1x TLE על ידי פיפטינג או מערבולת והעברה ליחידת מסנן צנטריפוגלית (CFU) של 0.5 מ”ל עם חיתוך משקל מולקולרי של 3 kDa. צנטריפוגה CFU במהירות מקסימלית במשך 10 דקות ולהשליך את הזרימה. יש לשטוף כל צינור אולטרה-צנטריפוגה עם 450 μL נוספים של 1x TLE ולהעביר ל- CFU שלו לשטיפה נוספת.הערה: שטיפת CFU בדרך זו מגבילה את אובדן הדנ”א תוך הפחתת ריכוז המלח. צנטריפוגה CFU במהירות מקסימלית במשך 10 דקות ולהשליך את הזרימה. הוסף 80 μL של 1x TLE לעמודה והפוך את הטור לצינור איסוף חדש לפני צנטריפוגה במשך 2 דקות במהירות מקסימלית כדי לקבל נפח סופי של ~ 100 μL. יש להוסיף 1 μL של RnaseA (1 מ”ג/מ”ל; דילול פי 10 של מלאי של 10 מ”ג/מ”ל) לכל דגימה ולדגור בטמפרטורה של 37°C על בלוק חום, באמבט מים או בתרמומיקסר למשך 30 דקות לפחות. לאחר הטיפול ב- Rnase, הסר את הדגימות מ- 37 °C ואחסן ב- 4 °C עד לשלב בקרת האיכות. בדיקת איכות הכרומטין, עיכול אנזימים וקשירת דגימותקרר את דגימות CI ו- DC לטמפרטורת החדר לאחר היפוך הקישורים הצולבים בשלב 2.4.5. לאחר מכן, העבר לצינור נעילת פאזה של 2 מ”ל.הערה: ודא שתכולת נעילת הפאזה היא צנטריפוגה לכדור (מהירות מרבית למשך 2 דקות). הוסף 200 μL של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל וערבב את הדגימות על ידי מערבולת במשך דקה אחת. צנטריפוגה את הצינורות במשך 5 דקות במהירות מקסימלית. העבר את הפאזה המימית מכל דגימה (~ 50 μL) לצינור מיקרופוגה חדש של 1.7 מ”ל. יש להוסיף 1 μL של Rnase A (מ-1 מ”ג/מ”ל) ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות לפחות. העמיסו את הדגימות על ג’ל אגרוז של 0.8% כפי שמומלץ בטבלה 4.הערה: התוצאות הצפויות מבקרת איכות מוצגות באיור 2. כימות הדנ”א על ידי דחיסות מהג’ל או באמצעות קיוביט או ננודרופ.הערה: כימות מדויק מבטיח את נפח הקלט הנכון בחלק הבא של הפרוטוקול. השתמש במספר תקנים עם כמות ידועה כדי לבנות עקומה סטנדרטית. טבלה 1: ריאגנטים לעיכול. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 2: ריאגנטים למילוי ביוטין. *שים לב שאנזימים משתנים עשויים לדרוש מאגרים שונים ו-dNTPs שעברו ביוטינילציה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 3: ריאגנטים לתערובת ליגציה. קיצור: BSA = אלבומין בסרום בקר. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 4: פרמטרים להעמסת ג’ל להערכת איכות ובחירת גודל. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. איור 2: ג’ל אגרוז המציג תוצאות בקרת איכות טיפוסיות לאחר טיהור DNA . (A) בקרת CI צריכה להצביע על פס של דנ”א בעל משקל מולקולרי גבוה. (B) דגימות DC ו-Hi-C מראות מגוון גדלים של דנ”א. דגימת Hi-C, לאחר ששולבה לשברים גדולים יותר, צריכה להיות בעלת משקל מולקולרי גבוה יותר מה-DC. טווח הריכוזים של הסמנים מאפשר יצירת עקומה סטנדרטית. שים לב, בדוגמה זו, ה- CI נטען על ג’ל נפרד, אך מומלץ לטעון ולהפעיל את כל הדגימות והפקדים יחד. קיצורים: CI = שלמות הכרומטין; DC = בקרת עיכול; Hi-C = קרבה-ליגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. 3. הכנת ספריית ריצוף Hi-C הסרת ביוטין מקצוות לא קשוריםהכן תגובות להסרת ביוטין כפי שמוצג בטבלה 5.הערה: בדרך כלל, 10 מיקרוגרם דנ”א מספיקים, אך ניתן להשתמש בעד 30 מיקרוגרם. הפץ 2 x 65 μL aliquots מכל תגובה של 130 μL לשני צינורות PCR. העברה לתרמוציקלר או למכונת PCR ודגירה כמתואר בטבלה 5.הערה: ניתן לאחסן כאן דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (ימים עד שבועות), -20°C (לטווח ארוך), או להעביר אותן מיד לסוניקציה. סוניקציהאיחד את כפילויות הדגימה משלב הסרת הביוטין (נפח דגימה כולל של 130 μL) לצינור סוניקטור של 130 μL עבור סוניקציה. סוניק את הדגימות באמצעות הפרמטרים שניתנו בטבלה 6 כדי להשיג התפלגות צרה הדוקה מתחת ל- 500 bp.הערה: ניתן להשתמש בסוגים שונים של סוניקטורים, אך עבור התפלגות מקטע צרה (100-500 bp), הגדרות הסוניקטור עשויות לדרוש אופטימיזציה. בחירת גודל עם חרוזים מגנטייםפירמוט הדנ”א הסוניקטי מצינור(ים) הסוניקטור לצינור קשירה נמוך של 1.7 מ”ל. הבא כל דגימה לנפח כולל של 500 μL עם TLE אחד. נסה לקבל את עוצמת הקול קרוב ככל האפשר ל 500 μL, שכן היחס בין המדגם לתערובת חרוזים מגנטיים הוא חיוני לבחירת גודל. הוסף 400 μL של תערובת חרוזים מגנטיים לכל צינור כדי להשיג יחס של תערובת חרוזים מגנטיים לנפח הדגימה של 0.8.הערה: בתנאים אלה, חרוזים לוכדים מקטעי דנ”א >300 bp, שיהיו השבר העליון. הסופר-נאטנט יכיל שברים <300 bp, שיהיו השבר התחתון. מערבבים את הצינורות על ידי מערבולת ודוגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על סיבוב. עבור יחסי בחירת גודל אלה ואחרים, ודא שהנפח המלא של המדגם מתערבב היטב. חפש את “מצב לא יציב” כי כמה רוטורים יש, אשר עובד היטב עבור נפחים קטנים יותר. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על מפריד חלקיקים מגנטי (MPS). בזמן הדגירה, הוסיפו 500 μL מתערובת החרוזים המגנטיים לצינור קשירה טרי של 1.7 μL נמוך עבור כל דגימה.הערה: צינורות אלה ישמשו לבחירת הגודל הבא של החלק התחתון על ידי יצירת תערובת חרוזים מגנטיים ליחס דגימה של 1.1:1. השאר את הצינורות על MPS במשך 5 דקות. הסר את supernatant מן החרוזים ו resupancy עם 150 μL של תערובת חרוזים מגנטיים.הערה: שלב זה מונע רוויה של החרוזים עם DNA על ידי הגדלת מספר החרוזים מבלי להגדיל את נפח. העבר את הסופר-נטנט משלב 3.3.5 לצינור המסומן המוכן לבחירת השבר התחתון (שלב 3.3.8).הערה: 150 μL של תערובת חרוזים מגנטיים + 400 μL של תערובת חרוזים מגנטיים 0.8x (550 μL סה”כ) חלקי 500 μL של דגימה ראשונית = 1.1x תערובת חרוזים מגנטיים ליחס דגימה. מערבבים את צינורות השבר התחתון על ידי מערבולת ודוגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על סיבוב.הערה: החרוזים יקשרו מקטעי דנ”א >100 bp, והתוצאה תהיה שבר סופי הקשור לחרוזים של 100-300 bp. שים את צינורות השבר התחתון על MPS למשך 5 דקות (טמפרטורת החדר). הסר את הסופרנטנט וצנטריפוגה של הצינורות לזמן קצר כדי להסיר עוד יותר את הסופרנטנט ככל האפשר. שטפו את החרוזים משני השברים פעמיים באמצעות 200 μL של 70% אתנול והחזירו את החרוזים למשך 5 דקות על MPS בכל פעם. לאחר סיבוב מהיר בצנטריפוגה, הסר את האתנול לחלוטין ויייבש עוד יותר את החרוזים ב- MPS.הערה: יש לייבש עד שהאלכוהול מתאדה לחלוטין. הכדור צריך להיראות כמו שוקולד מריר ללא פיצוח (יכול לקחת ~ 10 דקות). השהה מחדש את שני השברים ב- 50 μL של מאגר TLE 1x. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולהקיש או להזיז את הצינורות כל דקה נוספת כדי לעורר ערבוב והבהרה. הפרד את החרוזים מהסופרנטנט ב- MPS למשך 5 דקות עבור שני השברים. שמור את הסופר-נטנט מכל דגימה. מכניסים את הסופר-נאטנט לצינור קשירה נמוך של 1.7 מ”ל.הערה: ניתן לשמור את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים או בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לטווח ארוך. הפעל ג’ל אגרוז של 2% כמו בטבלה 4 כדי לקבוע את איכות המדגם וכמותו. ראו איור 3 כדוגמה לג’ל כזה.הערה: אם מניסיון, סוניקציה ניתנת לשחזור רב, ניתן לדלג על ג’ל זה ולהמשיך לסיים את התיקון באופן מיידי. מומלץ למשתמשים להחזיק את השברים העליונים עד לאחר טיטרציה PCR. ניתן להציל כמויות דנ”א לא אופטימליות שידרשו הרבה הגברה של PCR מחומר בחלק העליון. לכמת את כמות הדנ”א מהג’ל ישירות לאחר יצירת עקומה סטנדרטית מכניסת סולם הדנ”א הידועה או באמצעות קיוביט או ננודרופ. תיקון סוףהכינו את תערובת התיקון הסופית כמו בטבלה 7 (כמות לכל תגובה שניתנה). מעבירים את 46 ה-μL הנותרים של דנ”א מלוטש מהשבר התחתון לצינורות PCR ומוסיפים 24 מיקרון מתערובת תיקון הקצה המוכנה. דגירה במכונת PCR, כפי שהוצע בטבלה 7. לאחר השלמת התוכנית, שמור את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד למשיכה כלפי מטה. משיכה כלפי מטה של מוצרי קשירה ביוטיניליים עם חרוזי ציפוי סטרפטאבידיןקבעו את כמות החרוזים המצופים בסטרפטווידין עבור כל ספרייה מתוך בחירת הגודל המאומת (שלב 3.3.19).הערה: חרוזים מצופים סטרפטאבידין אלה (תמיסה של 10 מ”ג/מ”ל) יכולים לקשור 20 מיקרוגרם של DNA דו-גדילי לכל חרוזים מ”ג (= 20 מיקרוגרם / 100 מיקרוגרם חרוזים). השתמש ב- 2 μL עבור כל 1 מיקרוגרם של DNA Hi-C אך לא פחות מ- 10 μL. מערבבים את החרוזים המצופים בסטרפטאבידין ומקטרים את נפח החרוזים הדרושים לכל ספרייה (שחושבו בשלב הקודם) לצינורות קשירה נמוכים של 1.7 מ”ל בודדים. יש להשעות את החרוזים ב-400 מיקרו-ליטר של מאגר הכביסה של Tween (TWB; ראו מתכון בטבלה המשלימה S1) ולדגור במשך ~3 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב (ראו הוראות בשלב 3.3.4). הפרד את החרוזים מהסופרנטנט ב- MPS למשך דקה אחת והסר את הסופרנטנט. לשטוף את החרוזים על ידי pipetting עוד 400 μL של TWB. הפרד את החרוזים מהסופרנטנט ב- MPS למשך דקה אחת והסר את הסופרנטנט. הוסף 400 μL של 2x מאגר כריכה (BB) (מתכון בטבלה משלימה S1) לחרוזים והחייאה. בנוסף, הוסף 330 μL של 1x TLE ואת הפתרון מתיקון קצה (משלב 3.4.3). דגירה של הדגימות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב על רוטטור. הפרד את החרוזים מהסופרנטנט ב- MPS למשך דקה אחת והסר את הסופרנטנט. הוסף 400 μL של 1x BB לחרוזים והחייאה. הפרד את החרוזים מהסופרנטנט ב- MPS למשך דקה אחת והסר את הסופרנטנט. הוסיפו 100 מיקרון ליטר של 1x TLE כדי לשטוף את החרוזים. הפרד את החרוזים מהסופרנטנט ב- MPS למשך דקה אחת והסר את הסופרנטנט. לבסוף, הוסף 41 μL של 1x TLE כדי להשעות את החרוזים. א-זנבהכינו את תערובת ה-A-tailing כמו בטבלה 8. צירו את התגובות לצינורות PCR ודגירה כמו בטבלה 8. הניחו את צינורות ה-PCR על קרח מיד לאחר ההסרה מהתרמוציקלר והעבירו את התכולה לצינורות קשירה נמוכים של 1.7 מ”ל. הפרד את החרוזים מהסופרנאטנט ב- MPS למשך דקה אחת והשליך את הסופרנטנט. הוסף 400 μL של חיץ קשירה 1x, מדולל מ 5x T4 DNA ליגאז חיץ עם מים אולטרה-טהורים. הפרד את החרוזים מהסופרנאטנט ב- MPS למשך דקה אחת, ולאחר מכן השליך את הסופרנטנט. הוסף מאגר קשירת 1x לנפח סופי של 40 μL. מתאם חישול אוליגוסהכינו מלאי אוליגו מתאם של 100 מיקרומטר (טבלה 9).הערה: הזמינו 250 nmoles של אוליגוס מטוהרים על ידי HPLC. אנאל את המתאמים בצינורות PCR כמתואר בטבלה 9. השתמש בתרמוציקלר PCR כדי להעלות בהדרגה את הטמפרטורה ב-0.5 °C/s ל-97.5 °C. החזק בטמפרטורה של 97.5°C למשך 2.5 דקות. השתמש בתרמוציקלר PCR כדי להעלות בהדרגה את הטמפרטורה ב-0.1 °C/s למשך 775 מחזורים (להגיע ל-20 °C). יש להחזיק את הטמפרטורה ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. הוסף 83 μL של חיץ חישול 1x (מתכון בטבלה משלימה S1) כדי לדלל את המתאמים ל-15 μM. אחסן את המתאמים בטמפרטורה של -20°C. קשירת מתאם רצףהכן את תערובת קשירת המתאם בצינור קשירה נמוך של 1.7 מ”ל (טבלה 10). ליגייט במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. הפרד את החרוזים מהסופרנאטנט ב- MPS למשך דקה אחת והשליך את הסופרנטנט. מוסיפים 400 μL של TWB ומעבירים את החרוזים למעלה ולמטה בזהירות לפני הדגירה על המסובב במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הפרד את החרוזים מהסופר-נטנט ב- MPS וחזור על שלב זה פעם נוספת. הפרד את החרוזים מהסופרנאטנט ב- MPS (~ 1 דקות), השליך את הסופרנטנט והוסף 200 μL של 1x BB. הפרד את החרוזים מהסופרנאטנט ב- MPS (~ דקה אחת) והשלך את הסופרנטנט. הוסף 200 μL של חיץ קדם-PCR 1x (מ-10x; מתכון בטבלה משלימה S1) והעבר לצינור קשירה נמוך חדש של 1.7 מ”ל. הפרד את החרוזים מהסופרנאטנט ב- MPS (~ דקה אחת) והשלך את הסופרנטנט. הוסף 20 μL של 1x טרום PCR Buffer ומערבבים על ידי פיפטציה. יש לשמור את הצינורות על הקרח בזמן השימוש או לאחסן בטמפרטורה של 4°C. אופטימיזציה של מספר מחזור ה-PCR על ידי טיטרציההגדר 30 μL של תגובות תערובת אב לכל דגימה כמו בטבלה 11 (כמות לכל תגובה שניתנה). הפעל את המספר הנמוך ביותר של מחזורים ולקחת aliquot 5 μL. הפעל 2-3 מחזורים נוספים על התגובה הנותרת לפני נטילת 5 μL aliquot הבא. חזור על הפעולה כדי לאסוף ארבעה אליקוטים. השתמש בפרמטרים של PCR מטבלה 11 עבור כל aliquot. הוסף 5 μL של מים ו-2 μL של 6x צבע לכל דגימה של 5 μL. הפעל על ג’ל TBE של 2% אגרוז (מתכון בטבלה משלימה S1) עם 25-150 ננוגרם של סולם משקל מולקולרי נמוך. ראו איור 4 לקבלת התוצאות הצפויות.הערה: מספר אופטימלי של מחזורים עבור הגברת PCR סופית בספרייה [שלב 3.10] הוא המספר הנמוך ביותר של מחזורים כדי לקבל מוצר נראה לעין על הג’ל פחות מחזור אחד. הגברה סופית של PCR בספרייההגדר תגובות של 12 x 30 μL כדי להגביר כל ספריה סופית לריצוף כמו בטבלה 11. מחזור תגובות ה-PCR לפי טבלה 11 לאחר קביעת מספר המחזורים לאחר טיטרציה של PCR (שלב 3.9.3). לאחר השלמת ה-PCR, איחד את דגימות השכפול לתוך צינור מיקרופוגה בעל קשירה נמוכה של 1.7 מ”ל. הנח את הצינורות על ה- MPS והעבר את ה- supernatant לצינור מיקרופוגה חדש עם קשירה נמוכה של 1.7 מ”ל. החזירו את שאריות החרוזים המצופים בסטרפטווידין ב-20 מיקרו-ליטר של מאגר אחד לפני PCR.הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בתבנית זו כאשר היא מאוחסנת ב-4 °C למשך ימים עד שבועות או לטווח ארוך ב-20°C-. הסרת פריימרים עם תערובת חרוזים מגנטייםהשתמש במאגר TLE אחד (מתכון בטבלה משלימה S1) כדי לכוונן את עוצמת הקול משלב 3.10.4 ל-360 μL בדיוק. לכל דגימה, הוסיפו 360 μL מתערובת החרוזים המגנטיים ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. על רוטטור, מערבבים את הדגימות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הפרידו את החרוזים מהסופר-נטנט ב-MPS בטמפרטורת החדר (3-5 דקות). שטפו את החרוזים פעמיים באמצעות 200 מיקרוליטר של 70% אתנול והחזירו את החרוזים למשך 5 דקות על MPS בכל פעם. סיבוב מהיר בצנטריפוגה ופיפטה מוחלטת מהאתנול. יבשו את החרוזים באוויר על ה-MPS כדי לאדות עוד יותר את האתנול.הערה: הכדור צריך להיראות כמו שוקולד מריר ללא פיצוח (יכול לקחת ~ 10 דקות). יש להוסיף 30 μL של מים אולטרה-טהורים ולהשהות את הדנ”א למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הזיזו את הצינורות כל 2 דקות כדי לסייע בערבוב. הפרד את החרוזים מהסופר-נטנט ב- MPS למשך 5 דקות. אסוף את הסופרנטנט מכל דגימה בצינור טרי של 1.7 מ”ל. הפעל 1 μL של הספרייה על 2% agarose TBE (מתכון בטבלה משלימה S1) ג’ל כדי לקבל התפלגות גודל שבר ולכמת את הספרייה הסופית (איור 5).הערה: עיכול ClaI יכול להתרחש רק עבור צמתים DpnII-DpnII ומשמש כבקרת קשירה חיובית שאמורה לגרום להתפלגות גודל מקטע נמוכה יותר עבור הספרייה הסופית. ספריות סופיות ניתן לאחסן במשך כמה ימים ב 4 °C, לטווח ארוך ב -20 °C, או מיד מדולל ונשלח לריצוף. טבלה 5: ריאגנטים להסרת ביוטין וטמפרטורות אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 6: פרמטרים לסוניקציה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 7: ריאגנטים לתיקון קצה וטמפרטורות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 8: ריאגנטים וטמפרטורות A-tailing. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 9: פריימרים PCR ואוליגוים עם מתאם קצה מזווג עם ריאגנטים לחישול. קיצור: 5PHOS = 5 ‘ פוספט. כוכביות מציינות בסיסי דנ”א זרחניים. # שלב אוליגו באינדקס עם אוליגו אוניברסלי כדי להפוך אותו למתאם בעל אינדקס. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 10: ריאגנטים לקשירת מתאם. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 11: ריאגנטים PCR ופרמטרים לרכיבה על אופניים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. איור 3: ג’ל אגרוז המציג תוצאות בחירה טיפוסיות לאחר גודל. מוצגים השברים העליונים והתחתונים עבור ארבע דגימות (ממוספרות 1-4) של DpnII-DdeI Hi-C. הנתיב הראשון עבור כל דגימה מכיל את השבר העליון, הנגזר מתערובת חרוזים מגנטיים 0.8x, והנתיב השני והשלישי מכילים דילול של השבר התחתון הנגזר מתערובת חרוזים מגנטיים 1.1x. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 4: ג’ל אגרוז עם תוצאות טיטרציה של PCR. החל מ-5 מחזורים של PCR, דגימות נלקחות לאחר כל 2 מחזורים (5, 7, 9 ו-11 מחזורים) עבור כל אחת מארבע ספריות. בהתבסס על נתון זה, 6 מחזורים נבחרו כמחזור האופטימלי עבור כל דגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 5: מוצרי PCR סופיים. לאחר ניקוי ובחירת גודל, מוצרי PCR (Hi-C) הועמסו ליד חלק מעוכל ClaI של אותה ספרייה (ClaI). שברים מעוכלים ClaI מצביעים על נוכחות של קשירת DpnII-DpnII מבוקשת. שים לב ש- ClaI אינו מעכל צמתי DpnII-DdeI, ולכן לא כל הקשיריות יתרמו להקטנת גודל מהגבלה זו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.