Härstamningsspårning av inducerbara fluorescerande märkta stamceller i den vuxna mushjärnan

Värdet för en ursprungsspårningsmuslinje
Analys av stamceller in vivo kan vara svårt eftersom många analyser som undersöker sådana celler bara fokuserar på att karakterisera dessa celler vid djurets död, vilket representerar en terminal ögonblicksbild i tid. För att bättre förstå processerna för spridning, differentiering och migration av stamfader, mellanliggande / övergångscelltyper och mogna celler över tid krävs en longitudinell analysmetod. Detta kan uppnås med härstamningsspårningsstudier där stam-/stamceller markeras outplånligt och kan följas hur länge som helst efteråt¹.

I den vuxna däggdjurshjärnan analyserades först processen för neurogenes genom vilken vuxenfödda neuroner skapas från stam- och stamceller via etikettretention med tymidin-H3 ^2,3,4 eller 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU)^5,6,7,8 . I dessa studier markerades proliferativa celler med tyminanalogen, som införlivades i cellernas DNA under replikation och celldelning /proliferation. Den markerade cellen, liksom deras avkomma, innehöll därför denna analog, som sedan identifierades post-mortem. Men medan tymidin-H3 och BrdU möjliggjorde märkning av proliferativa celler och deras avkomma i hjärnregioner där stamceller var dåligt förstådda, hindrades dessa studier av nackdelarna med dessa verktyg. Tymidin-H3 inducerar cellcykelstopp, apoptos och dosberoende DNA-synthämning⁹, medan BrdU markerar celler på varierande nivåer beroende på administreringsväg¹⁰ och tas upp av celler under reparation eller apoptos, liksom under celldelning¹¹. Effektivare märkningsmetoder har använts nyligen, såsom märkning med 5-etynyl-2′-deoxyuridin (EdU), men många av samma problem som BrdU är fortfarande¹². Dessa tillvägagångssätt är också begränsande genom att de markerar alla proliferativa celler, inte bara stamceller, och därmed kan tolkning av resultat förvirras. I den neurogena härstamningen behåller alla stam- och stamceller mitotisk kapacitet, och endast terminala / mogna neuroner är inte proliferativa. För astrocyter och mikroglia, men inte oligodendrocyter, upprätthålls proliferationen på obestämd tid 13,14,15.

Transgena möss som används för att härstamma endast celler som uttrycker ett protein av intresse, till exempel ett som bekräftats för att identifiera vuxna stamceller som vi använder här, har därför blivit vanligare när man undersöker stamceller och deras avkomma. Även om det är svårt att generera genom mustransgena tillvägagångssätt, möjliggör härstamningsspårning av muslinjer spårning av specifikt markerade celler i hjärnan och förlitar sig inte på spridning ensam. I Tet-On transgena mussystem inducerar administrering av tetracyklin eller doxycyklin (ett tetracyklinderivat) Cre-rekombinasuttryck i celler som har konstruerats med en omvänd tetracyklintransaktivator (rtTA), som transkriberas av en promotor av intresse. Den Tet-inducerbara Cre-drivna rekombinationen aktiverar sedan uttrycket av ett outplånligt fluorescerande eller självlysande protein i cellerna av intresse, beroende på vilken Rosa-reporter-mus som används. Dessa outplånligt markerade celler fortsätter att uttrycka denna reporter efter delning, differentiering eller migration, vilket möjliggör spårning av dessa celler och deras avkomma över tid eller efter olika ingrepp¹⁶. Fördelarna med transgena härstamningsmetoder inkluderar: 1) specificitet för spårning till en viss celllinje eller stamfader / stamcell markerad av rtTA, 2) outplånligt uttryck av det fluorescerande eller självlysande proteinet trots cellomsättning eller differentiering, 3) låg toxicitet, 4) villkorlig aktivering under någon punkt i djurets livscykel och 5) användarvänlighet med vanliga analyser, inklusive immunfärgning/immunofluorescens¹⁶.

Andra metoder för tidsmässigt inducerbara reporterverktyg hos möss inkluderar användning av Cre-ERT2-möss, som kan paras ihop med ROSA-GFP, ROSA-mTmG eller andra fluorescerande reportertransgener. Hos dessa djur driver ett cellspecifikt reglerande element, såsom en promotor eller förstärkare av intresse, produktionen av Cre-rekombinas, som endast kan aktiveras via administrering av tamoxifen. Medan Cre-ERT2-muslinjer möjliggör induktion av Cre i specifika cellinjer, finns det en mängd kunskap som beskriver effekterna av tamoxifen på vuxen neurogenes^17,18. Dessutom finns det många ROSA-drivna fluorescerande reportergener som kan användas istället för GFP eller mTmG, inklusive YFP eller CFP, vilket skulle möjliggöra alternativ fluorescerande märkning i andra fluorescerande våglängder. Dessa fluorescerande reportergener kan användas med Tet-On- eller Cre-ERT2-system.

Telomeras omvänd transkriptas (TERT) är den hastighetsbegränsande komponenten i holoenzym telomeras, som arbetar för att förlänga telomerer efter att de förkortats under celldelning^19,20. TERT har identifierats som en markör för vuxna vävnadsstamceller i tarmen ^21,22, benmärg²¹, lever ²³, fett²⁴, endometrium^25,26 och ben¹. Huruvida TERT-uttryck i dessa vuxna stamceller enbart är för telomerasutvidgande aktivitet eller för att utföra icke-kanoniska TERT-roller²⁷ är fortfarande okänt. TERT-uttryckande vilande vuxna stamceller (qASCs) har identifierats och spårats i hela kroppen med transgena härstamningsspårningsmöss för att studera dessa stamcellers multipotens och självförnyelseförmåga, liksom deras potential att aktivera, sprida, differentiera och migrera 1,22,23,28. Skapandet av Tert-rtTA-transgenen har utförts tidigare¹. I det här dokumentet kommer vi att beskriva användningen av en härstamningsspårning TERT-muslinje för att studera TERT + qASCs som vi har identifierat som en ny ASC-population i den vuxna mushjärnan.

Generering av en transgen härstamning som spårar muslinje
För att generera en härstamningsspårningsmuslinje med hjälp av Tet-On-systemet måste tre transgener kombineras inom ett enda djur genom musparning. Den första är en rtTA, uttryckt under kontroll av promotorn av genen av intresse (vår är TERT-rtTA). I en cell som uttrycker denna gen av intresse kommer rtTA därför att uttryckas. Den andra är en oTet-Cre-gen, som innehåller ett tetracyklinresponselement (TRE) som möjliggör transkription av Cre-rekombinas i närvaro av både ett rtTA-fusionsutskrift och tetracyklin eller doxycyklin. Tetracyklin eller doxycyklin kan administreras till ett djur via dricksvatten eller chow²⁹. Slutligen måste det finnas en gen som kommer att aktiveras av Cre-rekombinasklyvning. I detta manuskript är märkningsgenen vi kommer att beskriva Rosa26-mTmG-genen, som fram till Cre-rekombination kommer att transkribera mTomato (membranröd fluorescens i alla celler). Men om en cell uttrycker rtTA-transkriptet och innehåller tetracyklin eller doxycyklin, kommer Cre-rekombination av en uppsättning lox P-platser mellan mTomato- och mGFP-platserna att ändra R26-platsen och få cellen att producera membran EGFP (mGFP eller membrangrön fluorescens) istället för membrantomat. Den outplånliga karaktären hos denna mGFP-signal möjliggör in vivo-märkning och spårning av celler när de sprider sig, migrerar och differentierar. Efter spåret kan celler analyseras för uttryck av GFP via immunofluorescens i standard kryosektioner eller tjockare optiskt rensade hjärnor.

I det här dokumentet kommer vi att beskriva användningen av den specifika muslinjen, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. För att skapa denna trippel transgena muslinje parade vi först oTet-Cre-djur (The Jackson Lab-stammen #006234) med Rosa-mTmG-djur (The Jackson Lab-stammen #007676) för att skapa oTet-Cre::Rosa-mTmG dubbla transgena möss. Dessa djur genotypades med primers och PCR-mallar som anges i tilläggstabellerna 1 och 2. mTert-rtTA-möss (skapade av David Breault¹) parades med oTet-Cre::Rosa-mTmG-djur för att skapa mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-möss (figur 1A)^1,30. Verkningsmekanismen för mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-muslinjen illustreras i figur 1B.

Doxycyklininduktion och pulsjaktdesign
Vid planering av experiment är det viktigt att överväga flera faktorer som kommer att påverka resultatet av härstamningsspårningsexperiment, inklusive djurets ålder vid doxycyklininduktion, längden på administrering av doxycyklin (“puls” -perioden), tiden efter avlägsnande av doxycyklin före vävnadsuppsamling (“jakt” -perioden) och tidpunkten för eventuella ingrepp under dessa processer. Dessa överväganden för studiedesign är viktiga för att förstå de märkta cellerna och deras avkomma vid experimentets slut. Det första steget i processen är att identifiera djurets intresseålder och längden på doxycyklinadministrationen. Längre pulsperioder gör det möjligt för fler celler att uttrycka den rtTA-länkade promotorn att uttryckas och fler celler av intresse att outplånligt markeras. En celltyp som uppvisar övergående uttryck av genen av intresse kan kräva en längre pulsperiod än celler som kontinuerligt uttrycker genen av intresse. Men om målet med studien är att förstå kortsiktiga effekter av cellen av intresse eller ett akut ingrepp, kan pulsperioden inte vara för lång, eftersom när en cell är markerad kommer den att spåras genom valfritt antal förändringar under resten av pulsperioden. I några av våra studier användes en 2 dagars puls utan jaktperiod för att närmare efterlikna en direktreporter för TERT. Detta beror på att den minsta tiden för rekombination av Rosa-mTmG-genen är 2 dagar³¹.

Nästa viktiga period i ett pulsjaktsexperiment är längden mellan avlägsnande av doxycyklin och perfusion av djuret, även känt som “jakten”. Halveringstiden för doxycyklin hos möss är cirka 170 minuter oavsett administreringsväg, vilket möjliggör slutsatsen att doxycyklininduktion sannolikt inte längre förekommer flera timmar efter borttagning³². Det är dock viktigt att notera att doxycyklinmetabolismen är långsammare hos äldre möss, vilket kan leda till längre effektiva “pulsperioder” än unga djur³³.

Under jaktperioden kommer märkta celler att fortsätta att märkas, även efter spridning, differentiering eller migration. Avkomman från dessa celler kommer också att märkas. Målet med studien kommer att forma längden på pulsjaktparadigmet. Om målet med studien är att förstå regenereringen av en vävnad under en lång tidsperiod med cellerna av intresse kan en lång jaktperiod krävas. Slutligen måste tidpunkten för eventuella ingrepp eller behandlingar bestämmas. Administrering under pulsperioden kommer att påverka cellerna som uttrycker genen av intresse såväl som eventuell avkomma som skapats under denna tid, medan administrering under jaktperioden kan påverka mestadels avkomman från cellerna av intresse, även om detta beror på hur snabbt de märkta cellerna delar sig eller differentierar. Exempel på pulsjaktsexperimentella konstruktioner som vi har använt beskrivs i figur 2A.

Det är också viktigt att vara medveten om möjligheten till bakgrunds-GFP-signal på grund av läckande uttryck. Läckande uttryck uppstår som ett resultat av inneboende bindningspotential mellan rtTA och Otet-sekvenserna i frånvaro av doxycyklin och restaktivitet hos Otet-transgenen i frånvaro av rtTA (granskad i³⁴). Läckande uttryck representerar en svaghet i Tet-systemen, och även om läckan ofta är en acceptabel nackdel för systemet, kan situationer där det läckande uttrycket kan leda till toxicitet och dödlighet, såsom med difteritoxin (DTA) hos Otet-DTA-djur begränsa användningen av dessa system³⁵.

Hjärnbearbetning, sektionering och immunofluorescens av tunna sektioner för mikroskopi
För att analysera hjärnan hos möss efter ett härstamningsspårningsexperiment måste möss först perfuseras via transkardiell perfusion för att ta bort blod och CSF som kan leda till hög autofluorescens i hjärnan. Det finns två vanliga fixeringsmedel som djuret kan perfuseras med: Histochoice Tissue Fixative, ett glyoxalfixativ (GF) eller 4% paraformaldehyd (PFA). Glyoxala fixeringsmedel möjliggör en relativt skonsam fixeringsprocess med mindre tvärbindning än PFA. Detta minskar vävnadsstyvheten, minskar behovet av antigenhämtning och möjliggör mindre koncentrerade antikroppslösningar under immunfärgning. Men om de innehåller metanol kan detta tjäna till att öka autofluorescensen³⁶. Å andra sidan kommer PFA ofta att möjliggöra en mer robust fixering, och även om antigenhämtning kommer att krävas under immunfärgning, finns det antikroppar som bara fungerar med PFA-fixerade vävnader, och perfusion med 4% PFA krävs för den optiska clearingtekniken som beskrivs senare.

Följande perfusion är ett postfixeringssteg, där hjärnor nedsänks i samma typ av fixeringsmedel som används under perfusionen över natten. Detta gör det möjligt för alla hjärnregioner som kanske inte har fixerats helt under perfusionen att fortsätta att fixa. Därefter kommer hjärnor att inkuberas i sackaros i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna så mycket vatten som möjligt före frysningssteget för att förhindra isbildning i vävnaden (“kryokonservering”). Hjärnor kan sedan skäras i valfritt antal sagittala, koronala eller tvärgående vävnadssektioner för bearbetning. För både precision och reproducerbarhet måste kalibrerade hjärnblock användas på ett sätt som säkerställer konsekventa bregmaskärningar mellan djur. Den viktigaste faktorn som kan påverka hur hjärnor är sektionerade är hjärnregionerna av intresse. Till exempel, medan ett sagittalt snitt kan möjliggöra att fler hjärnregioner analyseras i en vävnadssektion, kommer detta snitt inte att tillåta analys av neuro/ gliogena regioner i den ventrikulära subventrikulära zonen (V-SVZ) eftersom de laterala och mediala sidorna av lateral ventrikel kommer att vara omöjliga att urskilja i den dimensionen och observeras bättre i koronalplanet. Detta kan vara en viktig skillnad att göra i vuxna neurogenesstudier, eftersom sidosidan av lateral ventrikel innehåller den neurogena V-SVZ, medan den mediala väggen i lateral ventrikel är en mer gliogen nisch³⁷.

Efter att vävnader har delats upp i koronala, sagittala eller tvärgående sektioner kommer de att frysas i block med hjälp av optimal kyltemperatur (OCT) inbäddningslösning. Här fryses hjärnor i detta inbäddningsmaterial, med användning av en blandning av torris och etanol. Om tunn sektionsanalys krävs kommer block att skivas på en kryostat, och beroende på den nedströmsanalys som krävs kan fästas på positivt laddade glasskivor som tunna sektioner (<20 μm). Glasglas som inte är laddade kan också användas, men användningen av oladdade diabilder kan leda till att vävnader lossnar från bilderna³⁸. Om medeltjocka fritt flytande vävnadssektioner (>20 μm) krävs, kommer vävnader att samlas in som fritt flytande sektioner. Om tjocka sektioner (0,5-4 mm) krävs krävs skivning av icke-frusna hjärnsektioner med ett vibratom. Det är viktigt att notera lagringsskillnaderna mellan sektioner på diabilder, som kräver frysning vid -20 till -80 °C och fritt flytande sektioner, som kommer att lagras vid 4 °C.

Hjärnröjning och helmonterad immunofluorescerande konfokalmikroskopi
Om en bredare, men mindre detaljerad analys av de härstamningsspårade cellerna i mushjärnan önskas, är en omfattande analys av tjockare segment av hjärnvävnad möjlig med iDISCO-hjärnrensning³⁹ följt av immunfärgning och kaklad z-stack konfokalmikroskopi eller ljusplåtmikroskopi. Här kommer stora delar av mushjärnan att rensas optiskt (en process av delipidering³⁹), vilket bättre möjliggör fluorescerande signalavbildning över en 1 mm vävnadssektion. Nackdelarna med denna process är hög autofluorescens och en minskad förmåga att få högupplösta bilder av cellmorfologi och detaljerad samfärgningsanalys på grund av de ökade arbetsavstånd som krävs jämfört med mer traditionella metoder (tunna kryosektioner eller fritt flytande sektioner). Av denna anledning rekommenderar vi hjärnröjning för att analysera de storskaliga spårningsresultaten i flera hjärnområden, istället för att försöka karakterisera eller analysera enskilda celler.