편광 현미경과 결합된 원자력 현미경을 사용한 간 경화도 측정

모든 동물 실험은 분자 유전학 연구소의 동물 관리 위원회에서 승인한 동물 프로토콜과 동물 실험에 대한 EU 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었습니다. 제시된 프로토콜의 전체 회로도는 그림 1에 나와 있습니다. 그림 1 : 마우스 간에서 영률의 AFM 평가의 전체 개략도. (A) 대조군 또는 처리된 마우스로부터 간을 분리한 후 절편화 및 -80°C에서 보관합니다(최대 보관, 2주). (B) 구형 비드를 캔틸레버에 부착하여 밤새 접착제를 경화시킵니다 (왼쪽). 캔틸레버 교정 후 시료 장착(오른쪽). (C) 밝은 콜라겐 구조를 시각화하기 위해 편광판과 분석기를 정렬 한 다음 AFM 캔틸레버 아래의 측정 필드와 카메라의 이미지를 오버레이합니다. (D) 강성 맵 획득 및 분석. 약어 : AFM = 원자력 현미경; PBS = 인산염-완충 식염수; OCT = 최적 절단 온도 화합물; CCl4 = 사염화탄소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 1. 샘플 준비 I 마취하에 자궁 경부 탈구로 안락사 된 마우스의 열린 복부에서 간을 절제하십시오. 왼쪽 측엽을 분리하고 드라이 아이스에서 급속 동결하여 엽의 측면 절반을 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 삽입합니다. OCT 포매 조직을 -80 ° C에서 보관하십시오.참고: 이전 연구에 따르면 강성 값은 냉동 조직과 신선한 조직 간에 유사합니다(25,26). 30 μm 두께의 간 섹션을 저온 물질을 사용하여 양전하를 띤 슬라이드에 놓고 AFM 측정 날까지 -80 ° C에서 슬라이드를 보관합니다. 2. 기기 설정 AFM 캔틸레버 팁에 5.7μm 비드 부착(보충 그림 S1, 단계 1-5)참고: 캔틸레버에 비드를 부착하는 것도 이전에 Norman et al.46에 의해 설명되었습니다.직경 5.7 μm의 멜라민 수지 비드의 현탁액을 유리 슬라이드의 절반 면적에 고르게 펴고 자연 건조하여 용매를 증발시킨다(보충 그림 S1, 단계 1). 슬라이드의 다른 절반에서 10μL 팁을 사용하여 작업 시간이 긴 미리 혼합된 에폭시 수지의 얇은 선을 만듭니다(보충 그림 S1, 단계 1). 제조업체의 지침에 따라 캔틸레버 프로브를 AFM 헤드에 로드합니다. 캔틸레버 프로브가 장착된 AFM 헤드로 슬라이드와 덮개를 장착합니다.참고 : SD-qp-BioT-TL-10 캔틸레버가 연구에 사용되었습니다. 미리 혼합된 에폭시 수지 접착제를 슬라이드 중앙으로 가져오고 낮은 힘으로 캔틸레버로 접착제에 접근합니다(이 프로토콜을 따르려면 설정값을 1V로 설정; 보충 그림 S1, 단계 2).알림: 슬라이드 표면에 접근하기 전에 레이저가 캔틸레버 팁의 중앙에 정렬되어 있는지 확인하십시오.tage 섹션 6, 파트 8, AFM 캔틸레버의 스프링 상수 보정의 2-3단계에 따라 높은 합계 볼륨으로 표시됩니다. 캔틸레버 프로브의 끝이 접착제와 접촉 한 후 슬라이드 바로 위로 이동하여 과도한 접착제를 제거하십시오. 이제 슬라이드에서 캔틸레버 팁을 집어넣고 슬라이드를 이동하여 중앙에 단일 비드를 가져옵니다(보충 그림 S1, 3단계). 더 높은 힘(설정점 2V)으로 AFM 캔틸레버 프로브로 비드에 다시 접근하여 캔틸레버 프로브의 중앙에 비드를 부착하고 최소 10초 동안 그대로 둡니다(보충 그림 S1, 4단계). 캔틸레버 프로브를 추출하고 실온에서 밤새 보관하여 접착제를 경화시키거나 에폭시 수지에 대한 지침을 따릅니다(보충 그림 S1, 단계 5). 편광판 및 분석기 설정간 절개 내에서 관심 영역을 찾으려면 편광판과 분석기로 현미경을 설정하십시오. 진동 방위각을 0°에서 90° 사이의 각도로 정렬하여 둘 중 하나를 다른 하나에 대해 수동으로 또는 자동화된 방식으로 회전시켜 투과광을 최소화하고 대물렌즈를 통과하는 특수 광선을 최대화합니다. 콜라겐 섬유가 편광 이미지(그림 2)의 어두운 배경에 대해 밝게 나타나는지 확인하고, 이는 이미지 히스토그램의 피크가 밝은 픽셀로 이동하여 반영됩니다. 그림 2: 대표적인 현미경 이미지는 명시야 이미지와 비교하여 편광 현미경에서 콜라겐 섬유의 뚜렷한 시각화를 보여줍니다. 3주 동안 CCl4로 처리된 마우스의 간 절편을 (A) 명시야 및 (B) 편광 현미경 검사를 실시하였다. 복굴절 콜라겐 섬유는 명시야 이미지와 비교하여 편광 이미지에서 흰색으로 명확하게 보입니다. 빨간색 상자는 AFM 측정에 사용되는 콜라겐이 풍부한 영역을 나타냅니다. 삽입은 빨간색 상자에 영역의 확대된 보기를 표시합니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어 : AFM = 원자력 현미경; CCl4 = 사염화탄소; CV = 중심 정맥; PV = 문맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 알림: 이 프로토콜의 경우 AFM 헤드는 편광판과 분석기를 삽입할 수 있는 적절한 도립 현미경에 설치할 수 있습니다. 배경 소음을 줄이기 위해 시스템을 격리 장치에 배치해야 합니다. AFM 캔틸레버의 스프링 상수 교정제조업체의 지침에 따라 캔틸레버 프로브(섹션 1, 파트 2, 파트 8, AFM 캔틸레버 팁에 5.7μm 비드 부착의 1-1단계에 따라 준비됨)를 AFM 헤드에 로드합니다. 측정 중 캔틸레버의 오염을 방지하기 위해 70% 에탄올로 캔틸레버를 청소하십시오. 팁에서 잔류 에탄올을 제거하기 위해 증류수로 광범위하게 씻으십시오. 접촉 모드를 활성화하고 측정 방법으로 힘 매핑을 선택합니다. 해당 버튼을 클릭하여 소프트웨어 탭에서 모든 관련 창(Z 스테퍼 모터, 전동 스테이지 제어, 데이터 뷰어, 포스 스캔 맵 오실로스코프, 레이저 정렬 및 카메라 창)을 엽니다. 소수성 마커 펜으로 표시된 약 2cm x 4cm의 영역에 1.2mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 깨끗한 유리 슬라이드를 장착합니다. AFM 헤드를 현미경 스테이지에 장착하고 캔틸레버가 PBS에 완전히 잠겨 있는지 확인합니다. 대물렌즈를 캔틸레버 팁에 집중합니다. 현미경에서 투과되는 빛의 강도를 줄여 모니터에서 레이저 위치를 더 잘 볼 수 있습니다. 레이저를 캔틸레버의 반투명 끝 (구형 비드가 부착 된 부분)으로 향하게하고 AFM 헤드의 손잡이를 사용하여 미러를 정렬하여 검출기에서 레이저 빔의 총 강도를 최대화합니다 ( 레이저 정렬 창의 합계로 표시됨). AFM 헤드에 있는 손잡이를 사용하여 포토다이오드 검출기를 정렬하여 레이저를 중앙에 배치합니다. 보정을 진행하기 전에 캔틸레버를 15분 동안 안정화시키십시오. 교정 관리자를 열고 캔틸레버 유형, 캔틸레버 치수 및 환경 조건을 삽입합니다. Calibrate(보정)를 클릭하여 스프링 상수와 감도(역 광학 레버 감도, InvOLS라고도 함)를 보정합니다. 제조업체의 선언에 따라 교정 후 얻은 스프링 상수의 정확성을 확인하십시오. 비접촉 모드에서 캔틸레버를 보정합니다(보정은 Sader et al.58에서 파생된 열 정리를 사용하여 소프트웨어에서 수행됨).알림: 캔틸레버의 스프링 상수는 캔틸레버의 강성을 나타내며 N/m 측면에서 변형 길이에 따라 변형될 때 캔틸레버의 저항력에 의해 주어집니다. 캔틸레버의 감도는 캔틸레버의 편향(나노미터)에 대한 응답으로 광 다이오드 응답 값(볼트 단위)을 나타내며 일반적으로 nm/V59로 표시됩니다. 비접촉 모드에서, 열 잡음 스펙트럼은 기록되고 교정 후에 AFM 제어 소프트웨어에 의해 유체역학 기능(60 )이 자동으로 장착된다. 피팅은 교정 매개 변수, 즉 스프링 상수 및 InvOLS를 제공합니다. 이 연구에 사용 된 SD-qp-BioT-TL-10 캔틸레버의 스프링 상수는 제조업체가 선언 한대로 0.09 N / m였습니다. 3. 샘플 준비 II 동결된 절편을 실온에서 2분 동안 해동(섹션 1, 샘플 준비 I에 설명된 대로 -80°C에서 보관)합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 1x PBS의 얼음처럼 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 섹션을 고정한 다음 1x PBS로 광범위한 세척 (5x)합니다. 조직 주위의 잔류 PBS를 닦고 간 부분 주위에 약 2cm x 4cm의 경계를 소수성 마커 펜으로 표시합니다. 샘플을 1x PBS로 덮습니다(경계 영역에 ~1.2mL의 1x PBS가 포함되어 있는지 확인). AFM 측정에 샘플을 사용하십시오.알림: PFA는 유해 화학 물질이므로 피부 나 눈에 닿지 않도록주의해서 취급해야합니다. 독성 흄을 방지하려면 PFA와 관련된 모든 절차를 인증 된 화학 흄 후드 또는 기타 승인 된 환기 구역에서 수행해야합니다. 4. 측정 설정 탭으로 이동하여 자동 저장을 선택하여 자동 저장을 활성화합니다. 측정 파일을 저장할 파일 이름과 디렉토리를 설정하려면 설정 탭으로 이동한 다음 설정 저장을 클릭합니다. 샘플을 로드합니다(섹션 3, 샘플 준비 II에 따라 준비됨). 레이저 를 켜고 접근 키를 클릭하여 AFM 캔틸레버로 조직 표면에 접근 합니다. 팁이 조직 표면과 접촉한 후 팁이 대물렌즈의 초점에 유지되도록 캔틸레버 팁을 후퇴시킵니다(캔틸레버를 피에조 범위의 상단 끝으로 후퇴시키는 Retract 키를 클릭하여). 레이저 위치가 레이저 정렬 창의 중심에서 멀어지면 감지기를 다시 정렬하십시오. 레이저를 끄고 액세서리 탭을 클릭한 다음 직접 오버레이 광학 교정을 선택하여 현미경의 광학 필드를 AFM 측정 맵으로 오버레이합니다. 다음 창에서 다음을 클릭하여 특정 영역을 스캔하는 캔틸레버의 일련의 이미지를 찍습니다. 다음을 다시 클릭하여 다음 창으로 이동합니다. 첫 번째 이미지에서 캔틸레버 끝의 중심을 수동으로 클릭하여 소프트웨어에서 팁 위치를 나타냅니다. 팁 위치를 나타내는 원은 정확도를 높이기 위해 반경 을 표시하여 크기를 조작할 수 있습니다. 보정을 클릭하여 모든 이미지에서 캔틸레버 팁 위치를 자동으로 감지합니다. 이미지를 통해 팁 감지의 정확성을 확인하십시오. Next(다음)를 클릭한 다음 Finish(마침)를 클릭하여 광학 오버레이를 완료하고 광학 보정 중에 캡처된 일련의 이미지를 저장합니다. 슬라이드의 더 높은 표면과의 충돌을 피하기 위해 캔틸레버를 더 집어넣으십시오. 스테이지를 이동하여 편광 이미지를 사용하여 데이터 뷰어 탭에 표시되는 녹색 상자 안에 콜라겐이 풍부한 영역을 배치합니다. 지정된 녹색 상자 안에 마우스 왼쪽 버튼을 길게 눌러 주위에 사각형을 만들어 콜라겐이 풍부한 영역을 선택합니다. 왼쪽의 그리드 탭에서 선택한 영역의 치수, 방향 및 해상도를 정의합니다. 새 스캔 영역 확인을 클릭하여 선택한 영역을 측정 영역으로 설정합니다. 피드백 루프의 IGain 및 PGain-파라미터를 기본값으로 유지하되, 주요 불안정성이 시스템 과민성의 형태로 제시되지 않는 경우. 이 프로토콜을 따르려면 IGain을 50Hz로, PGain을 0.001로 설정하십시오. 설정값을 1nN으로 설정합니다.알림: 설정점은 정지 상태 동안 팁-표면 상호 작용의 힘입니다. 대부분의 소프트 샘플(세포, 젤 및 조직)의 경우 0.5-2.0nN 범위의 설정값 값이 적합합니다. 연구 된 재료의 기계적 특성과 캔틸레버의 강성에 따라 상대 설정 값을 선택하십시오. 이 프로토콜의 경우 값을 5nN으로 설정합니다.알림: 상대 설정점은 힘-거리 곡선의 정점에 도달하고 팁 이동이 기준선으로 돌아갈 때 상호 작용의 최대 힘을 나타냅니다. 연질 재료 (1-50 kPa)의 경우이 매개 변수는 나노 뉴턴 (nN) 단위로 설정됩니다. 또한 소프트 캔틸레버(스프링 상수가 0.05N/m에서 0.35N/m인 경우)의 경우 적용할 수 있는 최대 힘은 약 50nN입니다. 그에 따라 설정값과 상대 설정값을 조정합니다.주어진 설정값 값이 구형 압자의 반경보다 큰 압입 깊이로 이어지지 않는지 확인하고, 그렇지 않으면 압입 표면을 영률 계산에서 적절하게 정의할 수 없습니다. 들여쓰기의 첫 번째 실행 후 들여쓰기 깊이의 평균값을 계산합니다. 기록된 데이터를 처리하는 방법을 알아보려면 섹션 5, 데이터 분석을 참조하십시오. 필요한 경우 설정값 조정. 기준선 조정을 5로 설정합니다.참고: 여기서 기준선은 접근 곡선 및 수축 곡선을 피팅하는 데 사용되는 다항식의 정도를 나타냅니다. 기준선을 5로 설정하면 곡선이 고해상도에 적합하므로 측정 중에 배경 노이즈를 캡처할 수 있습니다. 샘플의 표면 지형에 따라 Z축에서 캔틸레버 이동 길이(Z-길이)를 선택합니다. 이 프로토콜을 따르려면 Z 길이를 15μm로 설정하십시오.참고: 높은 값(예: 15μm)은 측정 감도를 감소시키지만 일반적으로 섬유성 간 조직과 같이 표면이 매우 불규칙한 샘플에 필요합니다. Z 이동을 일정한 지속 시간으로 설정합니다.알림: Z 이동을 일정 속도로 설정하여 다른 모드에서 Z 이동(속도 연장 및 시간 연장)을 참조하는 데이터를 볼 수도 있습니다. 연장 시간을 1초로 설정합니다. 연장 지연 및 철회 지연을 0으로 설정합니다.참고: 매우 부드러운 재료61의 경우 >5.0μm/s의 확장 속도를 사용하십시오. 압입 속도가 낮을수록 부드러운 표면에서 더 점성이 높아지고 탄성이 떨어집니다. 확장 지연 및 수축 지연 은 캔틸레버 팁과 기질 간의 특정 상호 작용(예: 캔틸레버 표면에 고정된 단백질과 슬라이드 표면에 고정된 단백질의 상호 작용)을 연구하는 데 사용할 수 있는 매개변수입니다. 샘플 속도를 5000Hz로 설정합니다.참고: 샘플 속도는 완전한 접근-수축 곡선에 기록된 점의 빈도를 나타냅니다. 이 값을 높은 값(예: 5000Hz)으로 설정하여 매우 빠른 전환으로 인해 곡선의 특정 영역이 누락되지 않도록 합니다. Z 폐쇄 루프를 Tick으로 표시하여 피드백 루프 시스템을 활성화하여 샘플 표면과 캔틸레버 팁 사이의 연속 거리를 보장합니다. Engage(참여)를 선택 해제하고 접근 클릭을 선택하여 전동 스테이지를 분리하여 캔틸레버로 샘플에 접근합니다. 스캔 시작을 클릭하여 6단계에서 설정한 영역에서 힘-거리 곡선 수집을 시작합니다. 섹션 4, 측정. 5. 데이터 분석 오픈 소스 소프트웨어 “AtomicJ”(https://sourceforge.net/projects/jrobust/ 에서 다운로드 가능)를 사용하여 수집 된 데이터를 분석하십시오.참고: 애질런트 테크놀로지스, JPK 인스트루먼트 또는 브루커 원자력 현미경에서 수집한 파일을 지원합니다. AtomicJ에서 프로세스 힘 곡선 및 맵 아이콘을 클릭하여 힘 곡선 을 프로그램에 로드합니다(보충 그림 S2A, x). 처리 도우미에서 추가 버튼을 클릭하여 분석할 맵을 추가합니다(보충 그림 S2A, y). 지도가 로드된 후 다음을 클릭합니다(보충 그림 S2A, z). 아래 설명된 단계에 따라 다음 창에서 처리 설정을 지정합니다( 보충 그림 S2B, 단계 1-11의 단계에 해당).표본과 캔틸레버 사이의 접촉점을 수동으로 계산하거나 피팅 곡선 매개변수 세트를 사용하여 자동으로 추정합니다. 이 프로토콜을 따르려면 접점의 자동 추정을 사용하십시오. 캔틸레버와 샘플 사이의 접촉점을 클래식 포커싱 그리드 방법으로 결정합니다. 데이터 분석 최적화 중에 경험적으로 결정해야 하는 측정된 힘 곡선의 품질을 기반으로 접촉점을 가장 잘 결정할 수 있는 추정 방법을 선택합니다. 이 프로토콜을 따르려면 모델 독립적 메서드를 사용합니다. 클래식 모델을 사용하여 힘 압입 곡선을 피팅합니다(이 프로토콜을 따르려면 모델 피팅에 클래식 L2 사용).참고: 모형 적합치와 접촉 추정기는 각각 소프트웨어에 의해 곡선이 피팅되는 방법과 적합된 곡선에서 접촉점이 설정되는 방식을 제어하는 모수입니다. 이러한 측정에는 최소 제곱 회귀를 사용하는 클래식 옵션이 사용되었습니다. 이렇게 하면 곡선의 각 저하중 점을 시행 접촉점으로 처리하고 시행 접촉점 앞의 영역에 다항식을 피팅합니다. 그런 다음 수집된 힘 압입 데이터에 적절한 접촉 모델을 피팅합니다. 가장 낮은 제곱합을 제공하는 점이 접촉점으로 가정합니다. 얻어진 힘 곡선의 품질(62,63)에 기초하여 다른 방법들이 사용될 수 있다. 모형의 피팅 을 철회 곡선으로 설정합니다. 푸아송 비율을 0.45로 설정하고 간24와 같은 연조직에 권장됩니다. 기준선 차수 3과 접촉 차수 1을 사용하여 곡선의 피팅을 설정합니다. 모델에서 곡선의 편차 척도를 기반으로 다항식 피팅 정도를 변경합니다. 인출 곡선을 피팅하는 데 사용되는 모델을 선택합니다. 방정식 (1)과 방정식 (2)를 기반으로 영률을 계산하는 Sneddon 모델을 사용하십시오.(1)δ = (2)여기서 F는 힘, E는 영률, v는 샘플의 포아송 비율, δ는 압입 깊이, a는 접촉 반경, R은 구 반경62,63입니다. 구형 팁의 반경 을 마이크로미터 단위로 입력합니다(이 프로토콜에서는 2.9μm ). 읽기를 활성화하여 데이터 파일에서 Spring 상수 및 InvOLS를 로드합니다(확인란 선택). 마침을 클릭합니다.참고: 분석된 데이터는 각 힘 곡선에 대해 계산된 수직 처짐, 높이, 접착력, 접촉력, 변형, 접착력,R2 값, 기울기, 영률, 전이 압입, 전이력 및 접촉 위치의 맵 형태로 제공됩니다(보충 그림 S3, 왼쪽 상단). 두 개의 추가 창에는 힘 곡선과 원시 값이 표시됩니다(보충 그림 S3, 각각 오른쪽 상단 및 하단 패널). 캔틸레버가 간 섹션의 표면에 잘못 접근한 힘 곡선을 제외합니다. 이를 식별하기 위해, 도 3 에 시연되고 다른 곳(46)에서 상세히 논의된 바와 같이, 높은 잡음, 비정상적인 형상, 및/또는 불완전한 접근법을 갖는 곡선을 찾는다. 그림 3: 대표적인 힘-변위 곡선의 예. (A,B) 더 단단한에 대한 대표적인 해석 가능한 힘 곡선 (A; E = 10.5 kPa) 및 더 부드러운 (B; E = 1.78 kPa) 분석에 적합한 영역. (C-F) (C-E) 잘못된 접근 방식 또는 (F) 더 높은 잡음으로 인해 분석에서 제외해야 하는 해석할 수 없는 대표적인 그래프. (A)에 제공된 범례에 표시된 것처럼 빨간색 곡선은 캔틸레버의 접근 방식을 나타내고 녹색 곡선은 캔틸레버의 수축을 나타냅니다. 검은 선은 캔틸레버의 철수 곡선의 피팅을 보여줍니다. 검은 선의 기울기는 영률에 해당합니다. 빨간색과 파란색 점은 각각 접점과 전환점에 해당합니다. 접촉점은 수축 중 캔틸레버와 기판 사이의 마지막 접촉점이며, 전이 점은 캔틸레버가 접근에서 후퇴로의 전환을 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.