使用原子力显微镜结合偏振显微镜测量肝硬度

所有动物实验均按照分子遗传学研究所动物护理委员会批准的动物协议和欧盟动物实验指令2010/63 / EU进行。所提出的协议的总体示意图如图 1所示。 图1：AFM评估小鼠肝脏杨氏模量的总体示意图。 （A）从对照或处理的小鼠中分离肝脏，然后在-80°C下切片和储存（最大储存，2周）。（B）将球形珠连接到悬臂上，随后用胶水固化过夜（左）。悬臂校准，然后进行样品安装（右）。（C）偏振片和分析仪的对齐以可视化明亮的胶原蛋白结构，然后将相机中的图像与AFM悬臂下方的测量区域叠加。（D） 获取刚度图和分析。缩写：AFM = 原子力显微镜;PBS = 磷酸盐缓冲盐水;OCT = 最佳切削温度化合物;CCl 4 = 四氯化碳。 请点击此处查看此图的大图。 1. 样品制备 I 从麻醉下因颈椎脱位而安乐死的小鼠打开的腹部切除肝脏。通过在干冰上快速冷冻，分离左侧叶并将左半叶嵌入最佳切割温度 （OCT） 化合物中。将OCT包埋的组织储存在-80°C。注意：以前的研究表明，冷冻组织和新鲜组织之间的刚度值相似25，26。 使用冷冻切片机将30μm厚的肝切片到带正电荷的载玻片上，并将载玻片储存在-80°C，直到AFM测量日不超过2周。 2. 设置仪器 将5.7μm磁珠连接到AFM悬臂尖端（补充图S1，步骤1-5）注意：珠子与悬臂的连接之前也由Norman等人描述过46。将直径为5.7μm的三聚氰胺树脂珠的悬浮液均匀地散布在载玻片面积的一半上，并风干以蒸发溶剂（补充图S1，步骤1）。 在载玻片的另一半，使用10 μL吸头，制作一条工作时间较长的预混环氧树脂细线（补充图S1，步骤1）。 根据制造商的说明将悬臂探头加载到AFM头上。 使用装有悬臂探头的AFM头安装滑块和盖子。注意：研究中使用了SD-qp-BioT-TL-10悬臂。 将预混环氧树脂胶带到载玻片的中心，并以低力接近悬臂上的胶水（将 设定值 设置为 1 V 以遵循此协议;补充图S1，步骤2）。注意：在接近载玻片表面之前，请按照第 2 部分第 3 部分“AFM 悬臂弹簧常数的校准”中的步骤 6-8 确保激光对准悬臂尖端的中心，由高总和电压指示。 悬臂探头的尖端与胶水接触后，将其移动到滑块上方以去除多余的胶水。 现在，从载玻片上收回悬臂尖端并移动载玻片以将单个珠子放在中心（补充图S1，步骤3）。使用具有更高力（设定点2 V）的AFM悬臂探头再次接近磁珠，将磁珠连接到悬臂探头的中心并放置至少10秒（补充图S1，步骤4）。 提取悬臂探头并在室温下保持过夜以使胶水硬化或按照环氧树脂的说明进行操作（补充图S1，步骤5）。 设置偏振片和分析仪要定位肝脏切片内感兴趣的区域，请使用偏光片和分析仪设置显微镜。通过手动或以自动方式旋转其中一个方位角，以0°和90°之间的角度对齐它们的振动方位角，以最小化透射光并最大化通过物镜的非凡光线。确保胶原纤维在偏振图像的黑暗背景下看起来很亮（图2），这通过图像直方图的峰值向明亮像素的偏移来反射。 图 2：与明场图像相比，代表性显微镜图像在偏振显微镜中显示出胶原纤维的明显可视化。 用CCl 4 处理3周的小鼠的肝脏切片进行（A）明场和（B）偏振显微镜检查。与明场图像相比，偏振图像中的双折射胶原纤维在白色中清晰可见。红色框表示用于AFM测量的富含胶原蛋白的区域。插图在红色框中显示该区域的放大视图。比例尺 = 100 μm。缩写：AFM = 原子力显微镜;CCl 4 = 四氯化碳;CV = 中央静脉;PV = 门静脉。 请点击此处查看此图的大图。 注意：对于此协议，AFM头可以安装在任何合适的倒置显微镜上，并可以插入偏光片和分析仪。系统必须放置在隔离单元中，以减少背景噪音。 AFM悬臂弹簧常数的校准根据制造商的说明将悬臂探头（根据第2部分第1部分“将5.7μm珠子连接到AFM悬臂尖端”中的步骤1-8制备）加载到AFM头上。 用70%乙醇清洁悬臂，以防止在测量过程中污染悬臂。用蒸馏水充分清洗，以去除尖端残留的乙醇。 启用 接触 模式并选择 力映射 作为 测量方法。 通过单击相应的按钮，打开软件选项卡中的所有相关窗口（Z 步进电机、电动载物台控制、数据查看器、力扫描图示波器、激光对准和 相机 窗口）。 将含有 1.2 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的干净载玻片安装在约 2 cm x 4 cm 的区域内，用疏水性记号笔划定。将AFM头安装在显微镜载物台上，并确保悬臂完全浸入PBS中。 将物镜对准悬臂尖端。降低显微镜上透射光的强度，以更好地观察显示器上的激光位置。 将激光对准悬臂的半透明端（球形珠连接在其下方），并使用AFM头上的旋钮对准镜子，以最大化探测器上激光束的总强度（由 激光对准 窗口中的总和表示）。 使用AFM头上的旋钮对准光电二极管检测器，将激光定位在其中心。 让悬臂稳定15分钟，然后再进行校准。 打开 校准管理器 并插入 悬臂类型、悬臂尺寸和环境 条件。通过单击校准来校准弹簧常数和灵敏度（也称为反向光学杠杆灵敏度，InvOLS ）。使用制造商的声明确认校准后获得的弹簧常数的准确性。在 非接触 模式下校准悬臂（校准由软件使用Sader等人58推导的热定理执行）。注意：悬臂的弹簧常数表示悬臂的刚度，由悬臂根据变形长度变形时的阻力给出，以N / m为单位。悬臂的灵敏度描述了光电二极管响应悬臂偏转（纳米）的值（以伏特为单位），通常以nm / V59表示。在非接触模式下，热噪声频谱被记录下来，并在校准后由AFM控制软件自动安装流体动力功能60 。接头提供校准参数，即弹簧常数和InvOLS。本研究中使用的SD-qp-BioT-TL-10悬臂的弹簧常数为0.09 N / m，如制造商所述。 3. 样品制备 II 将冷冻部分（储存在-80°C，如第1节，样品制备I中所述）在室温下解冻2分钟。 用冰冷的4%多聚甲醛（PFA）在1x PBS中在4°C下固定切片10分钟，然后用1x PBS广泛洗涤（5x）。用纸巾擦拭切片周围的残留PBS，并用疏水记号笔在肝切片周围标记约2 cm x 4 cm的边界。用 1x PBS 覆盖样品（确保划定区域包含 ~1.2 mL 的 1x PBS）。使用样品进行 AFM 测量。注意：由于PFA是一种危险化学品，因此必须小心处理以防止与皮肤或眼睛接触。为避免其有毒烟雾，所有涉及PFA的程序必须在经过认证的化学通风柜或其他经批准的通风区域进行。 4. 测量 通过转到 “设置 ”选项卡并在“自动保存”上打勾来启用 自动保存。指定用于保存测量文件的文件名和目录，方法是转到 “ 设置”选项卡，然后单击 “保存设置”。 上样（根据第 3 节，样品制备 II 制备）。通过打开 激光 并单击 接近 键，使用 AFM 悬臂接近组织表面。尖端与组织表面接触后，缩回悬臂尖端，使尖端保持在物镜的焦点上（通过单击缩回键，将悬臂 缩回 压电范围的顶端）。如果激光位置在 激光对准 窗口上远离其中心，请重新对齐探测器。 关闭 激光器 ，并通过单击 附件 选项卡，然后选择 直接叠加光学校准，用AFM测量图覆盖显微镜的光学场。在随后的窗口中，单击 “下一步 ”以拍摄悬臂扫描特定区域的一系列图像。再次单击 下一步 以转到下一个窗口。 在第一个图像中，手动单击悬臂尖端的中心以描绘软件中的尖端位置。可以通过指示其 半径 来操纵描述尖端位置的圆圈的大小，以提高准确性。单击 校准以自动检测所有图像中的悬臂尖端位置。通过浏览图像确认尖端检测的准确性。 单击 下一步 ，然后单击完成以 完成 光学叠加并保存光学校准期间捕获的一系列图像。 进一步缩回悬臂以避免其与滑块上较高的表面发生碰撞。移动载物台以使用偏振图像将富含胶原蛋白的区域放置在“数据查看器”选项卡中可见的绿色框中。通过在指定的绿色框中长按鼠标左键在其周围制作一个矩形来选择富含胶原蛋白的区域。在左侧的“网格”选项卡下定义所选区域的尺寸、方向和分辨率。单击确认新扫描区域，将所选区域设置为测量区域。 将反馈回路的 IGain 和 PGain参数保持在默认值，如果没有以系统过度敏感的形式出现重大不稳定。要遵循此协议，请将 IGain 设置为 50 Hz ，将 PGain 设置为 0.001。 将 设定值 设置为 1 nN。注意： 设定点 是静止状态下尖端与表面相互作用的力。对于大多数软样品（细胞、凝胶和组织），设定 值 在 0.5-2.0 nN 范围内是合适的。 根据所研究材料的机械性能和悬臂的刚度选择 相对设定值 。对于此协议，请将值设置为 5 nN。注意： 相对设定点表示当达到力-距离曲线的峰值并且尖端运动返回到基线时的最大相互作用力。对于软材料 （1-50 kPa），此参数以纳牛顿 （nN） 为单位设置。此外，对于软悬臂（弹簧常数从0.05 N/m到0.35 N/m），可以施加的最大力约为50 nN。相应地调整设定值和相对设定值。 确保给定的设定值不会导致压痕深度大于球面压头的半径，否则在计算杨氏模量时无法正确定义压痕表面。计算第一次压痕运行后压痕深度的平均值;请参阅第 5 节 “数据分析”，了解如何处理记录的数据。如果需要，调整 设定值 。 将 调整基线 设置为 5。注意： 此处的 基线 是指用于拟合进近曲线和退刀曲线的多项式次数。将基线设置为 5 可使曲线适合高分辨率，从而确保在测量过程中捕获背景噪声。 根据样品的表面形貌在Z轴上选择悬臂运动的长度（Z长度）。要遵循此协议，请将 Z长度 设置为 15μm。注意：高值（例如 15 μm）会降低测量灵敏度，但对于具有高度不规则表面的样品（例如纤维化肝组织）通常需要测量灵敏度。 将 Z 移动 设置为 恒定持续时间。注意： Z 移动也可以设置为 恒定速度， 以便在不同模式下查看有关 Z 移动 （扩展速度 和 扩展时间）的数据。 将 延长时间 设置为 1 秒。将 延伸 延迟和 退刀延迟 设置为 0。注意：对于非常柔软的材料，请使用 >5.0 μm/s 的延伸速度61，因为较低的压痕速度将导致来自柔软表面的更粘性和更少的弹性响应。 伸展 延迟和回缩延迟 是可用于研究悬臂尖端和底物之间特定相互作用的参数（例如，固定在悬臂表面上的蛋白质与固定在载玻片表面上的蛋白质的相互作用）。 将 采样率 设置为 5000 Hz。注意： 采样率是指在完整的进近-退刀曲线上记录的点的频率。将其设置为较高的值（例如 5000 Hz），以避免由于曲线的转换速度极快而错过曲线的某些区域。 用刻度标记 Z 闭环以启用反馈回路系统，确保样品表面和悬臂尖端之间的距离。 通过取消选择“ 接合 ”并单击“ 接近 ”来脱离电动载物台，以使用悬臂接近样品。点击 开始扫描 开始在步骤6中设置的区域中收集力-距离曲线;第 4 节，测量。 5. 数据分析 使用开源软件“AtomicJ”（可从 https://sourceforge.net/projects/jrobust/ 下载）分析获取的数据。注意：它支持从安捷伦科技、JPK 仪器或布鲁克原子力显微镜收集的文件。 通过单击AtomicJ中的过程力曲线和映射图标，将 力曲线 加载到程序中（补充图S2A，x）。在 处理助手中，通过单击添加按钮 添加 要分析的地图（补充图S2A，y）。加载地图后单击 下一步 （补充图S2A，z）。 根据下面描述的步骤在下一个窗口中指定处理设置（对应于 补充图S2B，步骤1-11中的步骤）：通过计算或使用一组拟合曲线参数自动估计样品和悬臂之间的接触点。要遵循此协议，请使用接触点的 自动 估计。 通过经典聚焦网格法确定悬臂和样品之间的接触点。 根据实测力曲线的质量选择 估计方法 ，以产生接触点的最佳确定，这需要在数据分析优化时根据经验确定。若要遵循此协议，请使用 与模型无关的方法。 使用经典模型拟合力压痕曲线（使用经典 L2 进行模型拟合以遵循此协议）。注意： 模型拟合和接触估计器分别是控制软件如何拟合曲线以及如何在拟合曲线中建立接触点的参数。对于这些测量，使用了经典选项，该选项使用最小二乘回归。这会将曲线上的每个低力点作为试验接触点进行处理，并将多项式拟合到试验接触点之前的区域。然后，它将适当的接触模型拟合到收集的力压痕数据。假定给出最小平方和的点为接触点。可以使用基于力曲线62，63的质量得到其它方法。 将模型的 拟合 设置为 “退出” 曲线。 将 泊松比 设置为 0.45，建议用于肝脏24 等软组织。 使用 基线度 3 和 接触度 1 设置曲线的拟合。根据曲线与模型的偏差尺度更改多项式拟合度。 选取用于拟合退曲线的模型。使用 Sneddon 模型，该模型根据公式 （1） 和公式 （2） 计算杨氏模量：（1）δ = （2）其中 F 是力， E 是杨氏模量， v 是样品的泊松比，δ 是压痕深度， a 是接触半径， R 是球体半径62，63。 以微米为单位填写球形尖端的 半径 （本协议中为2.9μm ）。 通过启用读入（选中复选框）从数据文件加载弹簧常量和 InvOLS。 点击 完成。注意：分析的数据以垂直挠度、高度、附着力、接触力、变形、粘附力、R2 值、斜率、杨氏模量、过渡压痕、过渡力和为每条力曲线计算的接触位置图的形式呈现（补充图 S3，左上角）。另外两个窗口显示力曲线和原始值（补充图S3，分别是右上方和下图）。 排除悬臂错误地接近肝切片表面的力曲线。为了识别这些曲线，请寻找具有高噪声、异常形状和/或不完整方法的曲线，如图 3 所示，并在其他地方详细讨论46。 图3：代表性力-位移曲线示例。 （A，B）较硬的代表性可解释力曲线（A;E = 10.5 kPa）和较软（B;E = 1.78 kPa） 适合分析的区域。（C-F）由于 （C-E） 不正确的方法或 （F） 较高噪声而需要从分析中排除的代表性不可解释的图形。如（A）中提供的图例所示，红色曲线表示悬臂的接近，绿色曲线表示悬臂的缩回。黑线表示悬臂退出曲线的拟合。黑线的斜率对应于杨氏模量。红色和蓝色点分别对应于接触点和过渡点。接触点是悬臂和基板在缩回过程中的最后一个接触点，而过渡点描述了悬臂从接近到缩回的过渡。请点击此处查看此图的大图。