수인성 항생제 내성 박테리아의 분리 및 동정과 항생제 내성 유전자의 분자 특성 분석
Summary
여기에서는 물에서 항생제 내성 박테리아의 분리 및 식별과 항생제 내성 유전자(ARG)의 분자 특성 분석을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 배양 기반 및 비배양 기반(메타게놈 분석) 기술을 사용하면 인도 뭄바이의 담수에 존재하는 다양한 ARG의 총 박테리아 다양성과 총 풀에 대한 완전한 정보를 얻을 수 있습니다.
Abstract
담수 체와 관련된 미생물총을 통한 항생제 내성(AR)의 개발 및 확산은 주요 글로벌 건강 문제입니다. 본 연구에서는 기존의 배양 기반 기술과 고처리량 배양 독립적 메타게놈 접근 방식을 모두 사용하여 담수 샘플을 수집하고 총 박테리아 다양성 및 AR 유전자(ARG)와 관련하여 분석했습니다. 이 논문은 담수 샘플에서 전체 및 항생제 내성 배양 가능한 박테리아를 열거하고 배양 가능한 분리 물에서 표현형 및 유전형 내성을 측정하기위한 체계적인 프로토콜을 제시합니다. 또한, 우리는 배양 불가능한 박테리아를 포함한 전체 박테리아 다양성의 식별과 수역에서 다른 ARG (resistome)의 총 풀을 식별하기 위해 담수 샘플에서 추출한 전체 메타 게놈 DNA의 전체 메타 게놈 분석의 사용을보고합니다. 이러한 상세한 프로토콜에 따라 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU / mL 범위에서 높은 항생제 내성 박테리아 부하를 관찰했습니다. 대부분의 분리주는 세포탁심, 암피실린, 레보플록사신, 클로람페니콜, 세프트리악손, 겐타마이신, 네오마이신, 트리메토프림 및 시프로플록사신을 포함한 여러 테스트된 항생제에 내성이 있었으며 다중 항생제 내성(MAR) 지수는 ≥0.2로 분리균주에서 높은 수준의 내성을 나타냅니다. 16S rRNA 시퀀싱은 폐렴 클렙시엘라와 같은 잠재적인 인간 병원체와 코마모나스 종, 마이크로코커스 종, 아르트로박터 종 및 아에로모나스 종과 같은 기회주의적 박테리아를 확인했습니다. 분리 물의 분자 특성 분석은 blaTEM, blaCTX-M (β- 락탐), aadA, aac (6 ‘) -Ib (아미노 글리코 시드) 및 dfr1 (트리 메토 프림)과 같은 다양한 ARG의 존재를 보여 주었으며, 이는 또한 전체 메타 게놈 DNA 분석에 의해 확인되었다. 항생제 유출 펌프를 암호화하는 다른 ARGs의 높은 유병률-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-락타마제-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자 catB10, 및 리팜피신 내성 유전자 rphB-메타게놈 DNA에서도 검출되었다. 이 연구에서 논의된 프로토콜의 도움으로 다양한 AR 표현형 및 유전형 특성을 가진 수인성 MAR 박테리아의 존재를 확인했습니다. 따라서 전체 메타게놈 DNA 분석은 수역의 전반적인 AR 상태를 결정하기 위해 기존의 배양 기반 기술에 보완적인 기술로 사용될 수 있습니다.
Introduction
항생제 내성 (AMR)은 가장 시급한 글로벌 문제 중 하나로 확인되었습니다. AMR의 급속한 진화와 전 세계적인 확산은 이와 관련된 건강 비용 측면에서 인간의 건강과 세계 경제에 대한 가장 큰 위협 중 하나입니다1. 항생제의 남용과 오용은 AR의 증가로 이어졌습니다. 이것은 COVID-19 대유행에 의해 강조되었으며, 그 동안 많은 경우 관련 2 차 감염의 치료가 영향을받은 환자의 AMR로 인해 크게 손상되었습니다2. 인간에 의한 항생제의 직접적인 사용 / 오용 외에도 농업 및 축산업에서 항생제의 남용 및 오용과 수역을 포함한 환경으로의 부적절한 배출이 주요 관심사입니다3. 박테리아에서 새로운 내성 특성과 다제 내성의 증가는 AR의 발달과 보급으로 이어지는 요인에 대한 더 나은 이해의 필요성을 시급히 강조합니다. 플라스미드와 같은 이동성 유전 요소에 종종 여러 AR 유전자 (ARG)를 운반하는 여러 항생제 내성 박테리아는 이러한 내성 유전자를 잠재적 인 인간 병원체를 포함한 비 내성 미생물로 전달할 수 있으므로 최후의 수단 항생제로도 치료할 수없는 슈퍼 버그가 출현 할 수 있습니다4. 이러한 여러 항생제 내성 박테리아는 물 생태계에 존재하는 경우 물고기, 게 및 연체 동물과 같은 오염 된 수성 식품의 섭취를 통해 인간의 장에 직접 들어갈 수 있습니다. 이전 연구에 따르면 자연적으로 발생하는 수계에서 AR 박테리아의 확산은 식수를 포함한 다른 물 공급에도 도달 할 수 있으므로 인간 먹이 사슬에 들어갈 수 있습니다 5,6,7.
본 연구의 목적은 인도 뭄바이의 수역에 존재하는 총 박테리아 다양성 및 다양한 ARG의 총 풀에 대한 완전한 정보를 얻기 위해 배양 기반 및 비 배양 기반 (전체 메타 게놈 분석) 기술의 조합을 사용하는 포괄적 인 프로토콜을 제공하는 것입니다. 전통적으로 배양 기반 기술은 수역의 박테리아 다양성을 연구하는 데 사용되었습니다. 배양 가능한 미생물은 모든 틈새 시장에서 전체 미생물총의 작은 비율에 불과하므로 박테리아 다양성의 전반적인 상태와 모든 샘플에 만연한 다양한 내성 특성을 더 잘 이해하려면 다양한 배양 기반 및 배양 독립적 기술을 함께 사용해야 합니다. 이러한 강력하고 신뢰할 수 있는 배양 독립적 기술 중 하나는 전체 메타게놈 DNA 분석입니다. 이 고 처리량 방법은 박테리아 다양성 또는 다양한 ARG 8,9의 기능 주석에 대한 다양한 연구에서 성공적으로 활용되었습니다. 이 기술은 메타게놈(샘플의 전체 유전 물질)을 다양한 분석을 위한 출발 물질로 사용하므로 배양 독립적입니다. 본 연구의 프로토콜은 물 샘플에서 전체 박테리아 다양성 및 다양한 ARGs(resistome)에 대한 정보를 얻기 위해 전체 메타게놈 DNA 분석에 사용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
샘플 수집 및 처리는 중요한 역할을하며 연구 결과 및 해석에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 샘플의 변동성을 배제하려면 연구중인 담수 체의 여러 위치에서 샘플링을 수행하는 것이 중요합니다. 이러한 샘플을 취급할 때 적절한 무균 환경 조건을 유지하면 오염을 방지할 수 있습니다. 또한, 추출된 핵산의 품질 및 양에 영향을 미칠 수 있는 박테리아 조성의 변화를 방지하기 위해, 통과 조건은…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 뭄바이 대학의 과학 기술-대학 연구 및 과학 우수성 진흥 (DST-PURSE) 계획의 재정 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. Devika Ghadigaonkar는이 계획에 따라 프로젝트 펠로우로 일했습니다. 과학 기술부-과학 및 공학 연구위원회 (DST-SERB) 프로젝트 번호 : CRG / 2018 / 003624의 선임 연구원 인 Harshali Shinde가 제공 한 기술적 도움을 인정합니다.
Materials
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA – Not Applicable |
Referenzen
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