等离子体纳米颗粒的光学捕获用于 原位 表面增强拉曼光谱表征

1. 光学设置 将532 nm激光束（拉曼激发源）引导到光学镊子显微镜的弯曲端口（参见 材料表）。 使用750 nm长通二向色镜将532 nm激光束对准光学镊子显微镜的立体双层通路，以与原始捕获激光束相结合以聚焦在样品室上。 使用750 nm长通二向色镜从样品室收集背散射光，并将其重定向到包含液氮冷却电荷耦合器件（CCD）相机的光谱仪中（参见 材料表）。在光谱采集之前，将532 nm陷波滤光片放在光谱仪入口狭缝的前面。注意：打开激光时必须使用护目镜，并且激光束必须包含在安全区域内。 2. 银NP的制造 煮沸时在圆底烧瓶中加热 50 mL 1 mM AgNO3 水溶液。 将 1.0 mL 的 0.1 M 柠檬酸三钠溶液滴入煮沸的 AgNO3 水溶液中。 在不断搅拌下将混合物煮沸16分钟。 将混合物冷却至室温。观察到淡黄色。 在室温下以2000× g 离心AgNP胶体5分钟，然后使用移液管除去上清液。 用 1 mL 去离子水（电阻率为 18.2 MΩ cm）重悬 AgNP 胶体。 重复步骤2.5和2.6三次以除去残留的还原剂。 使用扫描电子显微镜 （SEM） 和动态光散射 （DLS）33 表征 AgNP 的尺寸分布，以确认 AgNP 的均匀性（图 2）。通过紫外吸光度34估计AgNP浓度为0.1nM。注意：由于浓度低，AgNP储备溶液可以在不聚集的情况下保持2-3周。不需要稳定剂。如果在AgNP储备溶液中观察到沉淀，则按照上述方案制备新的AgNP溶液。 3. DSNB分析物分子与AgNP的相互作用 将 200 μL 2 mM DSNB（参见 材料表）加入 1 mL AgNP 胶体中，并在室温下孵育 3 小时，通过形成 AgNP 和 DSNB35 之间的 Ag-S 键在 AgNP 表面上涂覆一层 DSNB。这种交互的示意图如图 3所示。 在室温下以2，000× g 离心AgNP5分钟，并除去上清液。 用 1 mL 去离子水重悬 AgNP-DSNB。 重复步骤 3.2 和 3.3 三次以删除多余的 DSNB。 记录AgNP胶体和AgNP-DSNB溶液的紫外可见光谱。注意：该光谱显示吸收峰从大约420 nm到450 nm，表明DSNB在AgNP表面上成功包覆（图3）。 4. 制备样品室并生成用于SERS测量的AgNP组件 用水和乙醇清洁载玻片和盖玻片。 将框架胶带（0.25 毫米厚，见 材料表）连接到载玻片上以创建一个腔室（1.0 厘米长× 1.0 厘米宽× 0.25 毫米高）。 将几滴 AgNP-DSNB 溶液（约 25 μL）加入框架中。 将盖玻片放在框架胶带上并密封（图4）。 将液氮加入液氮冷却CCD相机的容器中，直到温度达到-120°C。 使用磁性激光安全屏阻挡拉曼探头光束路径（参见 材料表），然后打开 532 nm 拉曼激发源激光器。 将样品室与AgNP-DSNB溶液固定在腔室支架上。向水浸物镜中加水（60倍放大倍率，1.2数值孔径A为1.2），如图 1所示。然后将腔室支架立即放在物镜上方的微载物台上。 将浸油滴在盖玻片顶部，并定位油浸式冷凝器以在显微镜相机上可视化颗粒。 通过转动显微镜旋钮来调整物镜的Z位置，直到532 nm拉曼探头光束聚焦在腔室的底部玻璃表面上，在显微镜相机上显示白点（图5）。调整微载物台的 X 和 Y 位置以移动腔室以将腔室的中心区域放置在白点处。打开光学镊子控制软件（见 材料表）并使用配备的操纵杆控制移动1064 nm捕获激光器（由光学镊子系统中的红色圆圈表示）与白点重叠（图5）。 接下来，调整显微镜的旋钮以向上移动物镜的Z位置。注意：显微镜相机图像中白点的消失表明532 nm拉曼探头光束聚焦在腔室内。 打开 1064 nm 捕获激光器以吸引样品室中的 AgNP，并创建等离子体 AgNP 组件。注意：AgNP的聚集导致样品室中出现黑点（图6B）。在需要时调低捕获激光束以避免过热或形成气泡。注意：如果没有明显的AgNP组件形成，请增加捕获激光功率和照射时间。 调整样品微载物台的位置，将等离子体AgNP组件的暗点放置在532 nm拉曼探针束的焦点下，以进行光谱测量。 将中性密度 （ND） 滤光片放在 532 nm 拉曼激光出口前面，将功率调节至 10 mW。在频谱软件的设置面板中输入采集时间（本研究为10 s，图6），然后单击采集按钮开始光谱采集。注意：这将生成分析物分子的SERS光谱（代表性结果和 图6中的DSNB）。