Präparation und morphologische Analyse von Küken-Schädel-Neuralleistenzellkulturen
Summary
Dieses vielseitige Protokoll beschreibt die Isolierung von primären Neuralleistenzellen (NCCs) durch die Exzision von kranialen Neuralfalten aus Hühnerembryonen. Nach der Beschichtung und Inkubation entstehen wandernde NCCs aus neuronalen Faltenexplantaten, was eine Beurteilung der Zellmorphologie und -migration in einer vereinfachten 2D-Umgebung ermöglicht.
Abstract
Während der Entwicklung von Wirbeltieren wandern Neuralleistenzellen (NCCs) ausgiebig und differenzieren sich in verschiedene Zelltypen, die zu Strukturen wie dem kraniofazialen Skelett und dem peripheren Nervensystem beitragen. Während es wichtig ist, die NCC-Migration im Kontext eines 3D-Embryos zu verstehen, erleichtert die Isolierung wandernder Zellen in 2D-Kultur die Visualisierung und funktionelle Charakterisierung und ergänzt embryonale Studien. Das vorliegende Protokoll demonstriert eine Methode zur Isolierung von Schädelfalten von Küken, um primäre NCC-Kulturen zu erzeugen. Wandernde NCCs entstehen aus neuronalen Faltenexplantaten, die auf einem fibronektinbeschichteten Substrat plattiert sind. Dies führt zu verstreuten, adhärenten NCC-Populationen, die durch Färbung und quantitative morphologische Analysen beurteilt werden können. Dieser vereinfachte Kulturansatz ist sehr anpassungsfähig und kann mit anderen Techniken kombiniert werden. Zum Beispiel können NCC-Auswanderung und Migrationsverhalten durch Zeitraffer-Bildgebung ausgewertet oder funktionell abgefragt werden, indem Inhibitoren oder experimentelle Manipulationen der Genexpression (z. B. DNA-, Morpholino- oder CRISPR-Elektroporation) einbezogen werden. Aufgrund ihrer Vielseitigkeit bietet diese Methode ein leistungsfähiges System zur Untersuchung der kranialen NCC-Entwicklung.
Introduction
Neuralleistenzellen (NCCs) sind eine vorübergehende Zellpopulation in Wirbeltierembryonen. NCCs werden an den Grenzen der Neuralplatte spezifiziert und durchlaufen einen epithelialen zu mesenchymalen Übergang (EMT), um aus dem dorsalen Neuralrohr1 zu wandern. Nach EMT verteilen sich NCCs weitgehend im gesamten Embryo und differenzieren und tragen letztendlich zu verschiedenen Strukturen bei, einschließlich des kraniofazialen Skeletts, des Ausflusstrakts des Herzens und des größten Teils des peripheren Nervensystems2. Veränderungen der Zellpolarität, des Zytoskeletts und der Adhäsionseigenschaften liegen dieser Verschiebung von einer primären zu einer wandernden Zellpopulation zugrunde3. Die Untersuchung von NCC EMT und Migration liefert Einblicke in grundlegende Mechanismen der Zellmotilität und informiert über die Bemühungen zur Vorbeugung und Behandlung von Geburtsfehlern und Krebsmetastasen.
Während die In-vivo-Analyse für das Verständnis von NCC-Entwicklungsprozessen in einem embryonalen Kontext von entscheidender Bedeutung ist, bieten In-vitro-Methoden visuelle und physische Zugänglichkeit, die zusätzliche experimentelle Wege ermöglichen. In einer vereinfachten 2D-Umgebung können NCC-Morphologie, Zytoskelettstrukturen und Distanz migriert ausgewertet werden. Darüber hinaus können die Auswirkungen der genetischen oder löslichen Faktorstörung auf das Migrationsverhalten beweglicher NCCs analysiert werden 4,5,6,7,8,9,10. Darüber hinaus können isolierte präpagratorische oder migrierende NCCs gesammelt, gepoolt und für Hochdurchsatzmethoden verwendet werden, um die Entwicklungsregulation von NCCs durch proteomische, transkriptomische und epigenomische Profilierung zu untersuchen 7,11. Während Methoden zur Herstellung von kranialen NCCs aus verschiedenen Entwicklungsmodellorganismen zur Verfügung stehen12,13,14, zeigt dieser Artikel die Mechanik des Ansatzes für diejenigen, die zuerst lernen, kraniale NCC aus Hühnerembryonen zu kultivieren.
Das aktuelle Protokoll beschreibt eine vielseitige Technik zur Herstellung von NCC-Kulturen des Kükenkrans (Abbildung 1). Da NCCs leicht aus explantierten Neuralfalten auf ein Kultursubstrat migrieren, trennen sich Hühner-NCCs auf natürliche Weise von embryonalem Gewebe, und Primärkulturen können leicht erzeugt werden. Da Mittelhirn-NCCs massenhaft aus den kranialen Neuralfalten wandern (im Gegensatz zur langwierigen Zell-für-Zell-Delaminierung im Stamm15), bestehen diese Kulturen hauptsächlich aus wandernden kranialen Neuralleistenzellen, wobei die anfängliche Neuralfaltenexzision eine Sammelmethode für premigratorische NCCs darstellt. Eine grundlegende Methode zur Sezierung und Kultivierung von Küken-Schädel-Neuralfalten wird detailliert beschrieben, und es werden Vorschläge für verschiedene Anwendungen und Variationen dieser Methode angeboten.
Abbildung 1: Schematische Übersicht des Kükenkranial-Neuralfaltenkulturprotokolls. (A,B) Schädelneuralfalten (blau umrandet) werden aus einem Hühnerembryo mit fünf Somiten herausgeschnitten (in dorsaler Ansicht in A). Graue Bänder, Herzsichel. (C) Wenn sie auf Fibronektin plattiert werden, treten wandernde Neuralleistenzellen aus den Neuralfalten aus und verteilen sich auf dem Substrat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Technik bietet eine anpassungsfähige Methode, um neuronale Kükenfalten zu isolieren und zu plattieren, um Kulturen von wandernden kranialen NCCs zu erzeugen. Diese Kulturen bieten vereinfachte 2D-Bedingungen für eine einfache Analyse der NCC-Migration und -Morphologie von Küken, die technisch anspruchsvollere Ovo-Bildgebungsverfahren ergänzen können24,25,26. Während diese In-vitro-Method…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Corinne A. Fairchild und Katie L. Vermillion, die an der Entwicklung unserer Version des Chick Cranial Neural Fold Culture Protocol beteiligt waren.
Materials
| AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software | Zeiss | Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Chamber dishes (glass bottom, single or divided) | MatTek; Cell Vis | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) |
Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm |
| Cover glass | Carolina Biological Supply Company | 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 | circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | Alternative for L15 media |
| Egg incubator | Sportsman | 1502 | |
| FBS | Life Technologies | 10437-028 | |
| Fibronectin | Fisher Scientific | CB-40008A | |
| Filter paper | Whatman | grade 3MM chromatography | |
| Forceps (blunt) | Fisher Scientific; Thomas Scientific | 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas) | |
| Forceps (fine) | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Image J | https://fiji.sc/ | Free image analysis software | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 media | Invitrogen | 11415064 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) | Vector Laboratories; Thermofisher Scientific | H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold) | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-148 | 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin |
| Petri Dishes | VWR (or similar) | 60 mm, 100 mm | |
| Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | multiple flurophores available |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | For tungsten needle (alternative for spring scissors) |
| Scissors (dissection) | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle) |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| Syringe Filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Tissue culture dishes | Sarstedt | 83-3900 | 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tungsten wire | Variety of sources | 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors) |
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