Isolement, culture et caractérisation des cellules de Schwann primaires, des kératinocytes et des fibroblastes du prépuce humain
Summary
L’étude de la cicatrisation des plaies associée aux lésions musculo-squelettiques nécessite souvent l’évaluation des interactions in vitro entre les cellules de Schwann (SC), les kératinocytes et les fibroblastes. Ce protocole décrit l’isolement, la culture et la caractérisation de ces cellules primaires à partir du prépuce humain.
Abstract
Ce protocole décrit les méthodes d’isolement, les conditions de culture et la caractérisation des cellules primaires humaines à haut rendement et viabilité en utilisant la dissociation enzymatique rapide de la peau. Les kératinocytes primaires, les fibroblastes et les cellules de Schwann sont tous prélevés sur le prépuce du nouveau-né humain, qui est disponible selon les procédures de soins standard. La peau enlevée est désinfectée et la graisse et les muscles sous-cutanés sont enlevés à l’aide d’un scalpel. La méthode consiste en une séparation enzymatique et mécanique des couches épidermique et dermique, suivie d’une digestion enzymatique supplémentaire pour obtenir des suspensions unicellulaires de chacune de ces couches cutanées. Enfin, les cellules individuelles sont cultivées dans des milieux de culture cellulaire appropriés en suivant les protocoles de culture cellulaire standard pour maintenir la croissance et la viabilité pendant des semaines. Ensemble, ce protocole simple permet l’isolement, la culture et la caractérisation des trois types de cellules à partir d’un seul morceau de peau pour l’évaluation in vitro de modèles peau-nerf. De plus, ces cellules peuvent être utilisées ensemble dans des co-cultures pour évaluer leurs effets les uns sur les autres et leurs réponses aux traumatismes in vitro sous la forme de égratignures effectuées robotiquement dans la culture associée à la cicatrisation des plaies.
Introduction
Les cellules primaires dérivées de tissus vivants et cultivées dans des conditions in vitro ressemblent étroitement à l’état physiologique1, ce qui en fait un modèle idéal pour étudier les processus physiologiques et physiopathologiques. La peau contient plusieurs types de cellules, y compris les kératinocytes, les fibroblastes, les sébocytes, les mélanocytes et les cellules de Schwann (SC), qui peuvent être isolés et cultivés pour des expériences in vitro . Les méthodes d’isolement et de culture des kératinocytes, des fibroblastes et des SC, à partir d’un seul morceau de peau, n’ont pas été décrites. L’objectif de ce protocole est double : 1) établir une méthode fiable et reproductible pour l’isolement et la culture des SC dermiques et 2) utiliser une méthode efficace et robuste pour l’isolement des kératinocytes, des fibroblastes et des SC d’un seul prépuce humain.
À l’heure actuelle, il existe des protocoles établis pour isoler les kératinocytescutanés 2,3,4 et les fibroblastes 5,6. Ces études décrivent l’isolement des kératinocytes, des fibroblastes ou des deux de la peau, mais aucun protocole ne traite de la façon d’établir des cultures de SC primaires à partir de la peau humaine. Des études récentes suggèrent que les SC neuronaux modulent les processus cellulaires des kératinocytes et des fibroblastes et régulent les fonctions physiologiques normales de la peau7. Les SC sont donc essentiels à l’homéostasie cutanée et contribuent de manière substantielle à la physiologie régulatrice qui influence le comportement des types de cellules cutanées voisines présentes8. Par conséquent, un protocole qui permet l’isolement de chacun de ces types de cellules est idéal pour les expériences in vitro impliquant la communication cellule-cellule ou la diaphonie entre les types de cellules.
Ce protocole décrit l’établissement de cultures cellulaires individuelles de cellules primaires à partir d’un seul morceau de peau. Ce protocole est particulièrement utile lorsque la quantité de tissu disponible est limitée. De plus, l’isolement des trois types de cellules d’un seul donneur permet des comparaisons robustes entre les types de cellules ou des expériences de co-culture tout en atténuant l’influence de la génétique au cours de l’expérience souhaitée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une méthode pour isoler trois populations cellulaires distinctes d’un seul morceau du prépuce, à savoir les kératinocytes, les fibroblastes et les cellules de Schwann. Il existe quelques protocoles d’isolement disponibles pour isoler les kératinocytes et les fibroblastes 2,3,5,6, mais aucun ne décrit l’isolement SC. Outre les cellules structurelles clés de la p…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr Fadia Kamal et le Dr Reyad Elbarbary de nous avoir permis d’utiliser des instruments de laboratoire et un soutien technique. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (K08 AR060164-01A) et du DOD (W81XWH-16-1-0725) à J. C. E. en plus du soutien institutionnel du Pennsylvania State University Hershey Medical Center.
Materials
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
Referenzen
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
- Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
- Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
- Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
- Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
- Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
- Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
- Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
- Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
- Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
