인간 호중구와 황색포도상구균 생물막 사이의 상호작용을 시각화하고 정량화하기 위한 표준화된 체외 분석

모든 절차는 오하이오 주립 대학 기관 검토위원회 (IRB) (2014H0154)의 승인을 받았습니다. 일차 인간 호중구를 분리하기 위해 말초 혈액을 수집하기 위해 모든 기증자로부터 정보에 입각 한 서면 동의를 얻었습니다. 황색포도상구균 (USA300 LAC)31 을 실험을 수행하기 위한 모델 유기체로 사용하였다. 실험은 혈액 매개 병원체에 대한 잠재적 노출로 인해 적절한 개인 보호 장비(PPE)로 수행되었습니다. 1. 체외 생물막의 제조 트립신 대두 한천 플레이트와 같은 영양이 풍부한 한천 플레이트 상의 줄무늬 플레이트 기술(32,33)을 사용하여 동결보존된 스톡(31)으로부터 S. 아우레우스의 단리된 콜로니를 수득한다(재료 표 참조). 96웰 플레이트의 개별 웰을 멸균H2O에 희석한 0.001%(v/v) 폴리-L-라이신(PLL) 100μL로 코팅하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 무균적으로, 진공 보조 흡인 트랩을 사용하여 PLL 용액을 흡인합니다. 우물을 실온에서 밤새 말리십시오.알림: 프로토콜의 모든 흡인 단계는 달리 명시되지 않는 한 진공 보조 흡인 트랩을 사용하여 수행됩니다. 2% 포도당이 보충된 최소 필수 배지 알파(MEMα)에 S. 아우레우스 의 콜로니를 접종하여 하룻밤 배양을 준비하고 37°C에서 배양하고 200rpm에서 16-18시간 동안 흔들어 배양합니다. 2% 포도당이 보충된 신선한 MEMα 5mL에 50μL를 옮겨 밤새 배양물을 희석하고, 일반적으로 0.5-0.8의 광학 밀도 600(OD600nm) 사이, 중간 대수상이 될 때까지 200rpm에서 흔들면서 37°C에서 배양합니다. MEMα를 사용하여 중간 로그 배양을 0.1의 OD600nm 로 정규화합니다. 150 μL의 정규화된 배양물을 PLL 처리된 96-웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 37 ° C의 가습 챔버에서 18-20 시간 동안 정적으로 배양합니다.참고: 생물막은 μ채널 슬라이드와 같은 다른 형식으로도 성장할 수 있습니다( 재료 표 참조). 상청액을 흡인하여 플랑크톤 세포를 제거합니다. 150μL의 행크스 밸런스드 솔트 용액(HBSS)으로 남은 바이오매스를 부드럽게 씻어 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 생물막이 파괴되지 않도록 HBSS를 적가하십시오.알림: 세척 중에 상청액과 HBSS를 흡입하는 동안 생물막이 여전히 잠기도록 생물막이 포함된 웰에 충분한 액체(상청액 또는 HBSS)만 남겨 두십시오. 이는 HBSS가 생물막을 세척하기 위해 적하될 때 생물막 구조의 파괴를 방지합니다. 1.6단계를 적어도 두 번 더 반복하여 모든 플랑크톤 세포를 제거합니다. 이 시점에서 생물막은 즉각적인 다운스트림 실험을 위한 준비가 되었습니다.참고: 생물막이 호중구 실험에 사용되지 않는 경우 HBSS를 인산염 완충 식염수(PBS)로 대체할 수 있습니다. HBSS는 호중구 활성화를 위한 최적 조건을 제공하는 글루코스를 포함하는 성분을 함유하기 때문에 PBS보다 HBSS가 선호된다(34). 2. 생물막 바이오매스의 정량화 20 % (v / v) 에탄올과 80 % (v / v) H 2 O에 용해시켜 0.1 % (w / v) 크리스탈 바이올렛 (CV) 용액 (재료 표 참조)의 재고를 준비하십시오. H2O를 첨가하기 전에 CV가 에탄올에 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 용액을 필터 멸균하십시오. 세척된 생물막에 0.1% CV 용액 150μL를 첨가하고 실온에서 20분 동안 배양한다. 세 개 이상의 빈 웰을 미디어 전용 컨트롤로 사용합니다. 생물막으로부터 0.1% CV 용액을 흡인하고, 염색된 생물막을 200 μL의 1x PBS로 세척한다. 이 과정을 총 세 번 세척하여 웰에서 과도한 CV를 제거합니다. H2O로 희석한 33%(v/v) 빙초산 150μL를 추가합니다. 실온에서 50rpm으로 로커에서 30분 동안 배양하여 바이오매스에 결합된 CV가 완전히 용해되도록 합니다.주의 : 빙초산은 부식성 화학 물질이므로 적절한 PPE가있는 층류 후드에서이 단계를 수행하십시오. 그 동안 마이크로플레이트 리더( 재료 표 참조)를 설정하여 CV 얼룩 값을 읽으십시오. 빙초산 처리 후 595nm 파장에서 플레이트를 읽습니다.참고 : CV의 OD를 측정하는 데 사용되는 파장은 500-600 nm35 범위 일 수 있습니다. 3. 호중구 분리 참고: 호중구는 경미한 변경36과 함께 이전에 발표된 방법에 따라 분리되었습니다. 이 분리 프로토콜은 먼저 밀도 구배 원심분리를 결합한 다음 3% 덱스트란 침강을 결합합니다. 이 섹션에서는 전체 호중구 분리 프로토콜만 다루며 게시된 프로토콜의 변경 사항에 중점을 둡니다. 또한, 아래에 요약된 프로토콜은 호중구를 분리할 수 있는 많은 방법 중 하나이며, 필요에 따라 치환될 수 있다. 호중구를 단리하기 위한 다른 방법은 세포 분리 배지 또는 자성 항체 세포 분리(37)의 사용을 포함한다. 기관 IRB에 설명된 프로토콜에 따라 정맥 천자를 통해 성인 기증자로부터 혈액을 채취합니다. 채혈하기 전에 주사기에 충분한 방부제가없는 헤파린이 있는지 확인하여 헤파린의 최종 농도가 20U / mL가되도록하십시오. 헤파린화 된 혈액을 실온에서 H2O 중 내 독소가없는 0.9 % NaCl (재료 표 참조)의 3/4 부피로 희석하십시오. 희석된 혈액 샘플 20mL마다 새로운 50mL 원추형 튜브에 시판되는 밀도 구배 배지( 재료 표 참조) 14mL를 분취합니다. 희석된 혈액 샘플을 밀도 구배 배지 위에 조심스럽게 놓습니다. 층상 혈액 샘플을 실온에서 40분 동안 400 x g 로 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 층을 방해하지 않도록 원심분리기가 천천히 끊어지는지 확인하십시오.참고: 혈액 샘플에는 식염수와 혈장의 혼합물, 단핵 세포층, 밀도 구배 배지, 호중구 및 적혈구가 포함된 5개의 층이 있습니다. 혈청 학적 피펫을 사용하여 호중구 및 적혈구 펠릿 위의 모든 층을 흡인 한 다음 H2O의 차가운 내 독소가없는 0.9 % NaCl에서 펠릿을 부드럽게 재현탁시킵니다. 20mL 혈액 샘플에서 생성된 각 펠릿에 대해 펠릿을 총 20mL 부피로 다시 재현탁합니다. 3 % 덱스 트란의 1 : 1 부피를 추가하십시오 ( 재료 표 참조). 얼음 위에서 18-20분 동안 튜브를 똑바로 세웁니다.알림: 3% 덱스트란이H2O에서 내독소가 없는 0.9% NaCl로 만들어졌는지 확인하십시오. 호중구와 일부 적혈구가 포함된 상층 20mL를 새로운 50mL 원추형 튜브에서 제거하고 355 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 부어 빨간색 펠릿을 남깁니다. 펠릿을 10mL의 차갑고 멸균 된 H2O에 30 초 동안 부드럽게 재현탁하여 나머지 적혈구를 용해시킵니다. 즉시 차가운 내 독소가없는 0.9 % 식염수 10mL를 혼합물에 첨가하여 긴장성을 회복시킵니다. 용액을 233 x g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리합니다. 상청액을 붓고 혈액 샘플 20mL당 1mL의 차가운 HBSS에 95%-97% 호중구가 포함된 펠릿을 재현탁합니다. 10 μL의 재현탁된 호중구를 90 μL의 0.4% 트리판 블루 배제 염료에 옮기고 혈구계를 사용하여 세포를 계수한다( 재료 표 참조).참고: 비생존 세포는 트리판 블루 배제 염료가 생존 세포에서 불투과성이므로 파란색으로 염색됩니다. 이 프로토콜은 >99 % 세포 생존율37,38을 제공합니다. 호중구의 최종 농도가 4 x 106 cells/mL가 되도록 HBSS를 추가합니다.참고: 세포 생존율이 <99%인 경우 4 x 106 cells/mL의 최종 농도를 여전히 달성할 수 있습니다. 그러나 얻은 4 x 106 cells/mL를 포함하는 용액의 총 부피는 감소합니다. 호중구의 최종 농도는 사용자의 실험 요구에 따라 조정될 수 있다. 호중구를 하기에 기재된 모든 실험에 대해 4 x 106 cells/mL 최종 농도로 재현탁시켰다. 기증자 대 기증자 가변성을 설명하기 위해 호중구와 관련된 모든 실험을 적어도 세 명의 다른 기증자와 함께 수행하는 것이 좋습니다. 4. 호중구에 의해 생성되는 ROS의 측정 세척된 생물막에 100 μL의 20% 정상 인간 혈청(HBSS로 희석)을 적가하고(단계 1.6) 30분 동안 정적 조건 하에 37°C에서 배양하여 생물막을 옵소닉한다. 20% 혈청 용액을 흡인하고 150μL의 HBSS로 생물막을 한 번 적가합니다. HBSS를 흡인하여 옵소닉화된 생물막이 있는 우물을 남깁니다.참고: 실험의 해석을 위해 (A) 호중구 + 생물막, (B) 호중구 + PMA(양성 대조군, 재료 표 참조), (C) 호중구 전용, (D) 생물막만 최소 4개 그룹이 권장됩니다. 최종 루미놀 농도가 50μM이 되도록 4 x 106 cells/mL의 농도로 HBSS에 재현탁된 호중구에 루미놀(재료 표 참조)을 추가합니다. 이 솔루션은 그룹 (A) 및 (C)에 사용할 준비가 되었습니다. 루미놀과 혼합 된 4 x 105 호중구를 opsonized 생물막이있는 웰에 첨가하십시오. 별도의 튜브에서 호중구가 없는 HBSS에 50μM 루미놀 용액을 준비하고 생물막이 포함된 웰(그룹 D)에 추가합니다. 루미놀과 혼합된 호중구 350μL를 분취하고, 혼합물에 500ng/mL의 최종 농도로 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)를 첨가한다. 그룹 (B)의 경우,이 혼합물의 4 x 105 호중구를 생물막이없는 웰에 첨가하십시오. 이것은 긍정적 인 대조군으로 작용합니다.참고: 이 단계에서 표시된 PMA 농도는 PMA 자극 호중구가 양성 대조군이므로 강력한 파열 반응을 보장하기 위해 상대적으로 높습니다. PMA는 실험에 따라 호중구를 활성화하기 위해 더 낮은 농도로 사용될 수 있습니다. 플레이트를 270 x g 에서 4°C에서 30초 동안 원심분리합니다. 플레이트 리더가 37분 간격으로 60분 동안 발광 및 키네틱 판독 설정과 함께 3°C로 설정되어 있는지 확인합니다. 플레이트를 플레이트 리더에 놓고 60분 동안 호중구에 의한 ROS 생성을 측정합니다.참고: 이 분석을 위해, 생물막은 발광 분석에 사용되는 백색 플레이트에서 성장시켰다. PMA는 산화적 파열 반응(39)에 대한 공지된 작용제이다. PMA와 관련된 연구를 수행 할 때 PMA가 즉시 버스트 반응을 시작하기 때문에 호중구가 포함 된 용액이 차가운 동안 마지막 단계에서 PMA가 추가되었는지 확인하십시오. 5. 영상화 생물막-호중구 상호작용 1.2-1.6 단계를 사용하여 생물막을 설정하십시오. 생물막 이미징을 용이하게 하려면 녹색 형광 단백질(GFP)40,41을 발현하는 USA300과 같은 S. 아우레우스의 형광 균주를 사용하여 현미경 이미징의 용이성을 높입니다.참고: 시험관 내 생물막 모델을 시연하기 위해 96웰 플레이트 대신 6개의 μ채널 슬라이드(재료 표 참조)를 사용했습니다(1단계). 4 x 106 cells/mL의 호중구를 100μM의 Blue CMAC(7-아미노-4-클로로메틸쿠마린) 염료(BCD, 재료 표 참조)와 함께 37°C 및 5%CO2의 로커에서 30분 동안 배양합니다. 샘플이 어둠 속에서 배양되었는지 확인하고 나머지 단계에서는 빛에 대한 노출을 제한하십시오. 과도한 BCD를 세척하려면 호중구를 270 x g 에서 5 분 동안 원심 분리하고 상청액을 흡인하십시오. 새로운 HBSS에서 호중구를 다시 중단하십시오. 이 시점에서 에티듐 동종이량체-1( 재료 표 참조)을 BCD 염색된 호중구에 최종 농도 4μM로 추가하여 호중구 및 박테리아 사멸을 모니터링합니다. 호중구 대 박테리아 비율이 1:30(호중구: 박테리아)이 되도록 μ 슬라이드에서 성장한 S. 아우레우스 생물막에 150μL의 호중구를 추가합니다. μ 슬라이드를 가습 챔버에서 30분 동안 배양합니다. 박테리아 세포의 수는 18 시간 생물막을 도금하여 얻은 세포 수를 기반으로합니다. 형광 염료/단백질의 여기 및 방출 파장에 해당하는 형광 채널을 사용하여 호중구-생물막 상호작용을 이미지화합니다.참고: 본 연구에서 BCD는 353/466 nm, 에티듐 호모다이머-1은 528/617 nm, GFP는 395/509 nm입니다. 샘플의 광퇴색을 방지하기 위해 레이저 또는 빛에 대한 샘플의 노출을 제한하십시오. 현미경 이미지 분석 소프트웨어 또는 FIJI/ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ 및 BAIT와 같은 프로그램을 사용하여 이미지를 분석합니다.알림: 얼룩으로 작업 할 때 사용중인 염료의 특이성을 고려하는 것이 중요합니다. 일부 얼룩은 원핵 세포와 진핵 세포에서 작동하는 반면 다른 얼룩은 하나에서만 작동합니다. 두 세포 유형을 모두 염색할 수 있는 염료를 사용하여 호중구와 생물막을 별도로 염색하는 경우 교차 염색을 방지하기 위해 호중구와 생물막을 결합하기 전에 남아 있는 염료를 씻어내야 합니다.