מודל הפטוציטים מוסמך הבוחן את כניסת נגיף הפטיטיס B דרך נתרן טאורוחולאט קוטרנספורטינג פוליפפטיד כמטרה טיפולית
Summary
אנו מציגים פרוטוקול לסינון תרכובות נגד נגיף הפטיטיס B (HBV) המכוונות לשלבי מחזור החיים של הכניסה לפני ואחרי הנגיף, תוך שימוש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית למדידת זיקה קושרת (KD) עם פוליפפטיד קו-טרנספורטינג של נתרן טאורוכולאט מארח. היעילות האנטי-ויראלית נקבעה באמצעות דיכוי סמני מחזור חיים נגיפיים (היווצרות cccDNA, שעתוק והרכבה ויראלית).
Abstract
זיהום בנגיף הפטיטיס B (HBV) נחשב לגורם סיכון מכריע לקרצינומה הפטוצלולרית. הטיפול הנוכחי יכול רק להפחית את העומס הנגיפי אך לא לגרום להפוגה מוחלטת. מודל הפטוציטים יעיל לזיהום HBV יציע מחזור חיים נגיפי נאמן לחיים שיהיה חיוני לסינון של חומרים טיפוליים. רוב הסוכנים הזמינים נגד HBV מתמקדים בשלבי מחזור החיים לאחר כניסה ויראלית אך לא לפני כניסה ויראלית. פרוטוקול זה מפרט את יצירתו של מודל הפטוציטים מוכשר המסוגל לבצע סינון לסוכנים טיפוליים המכוונים לשלבי מחזור החיים של כניסה טרום-ויראלית ופוסט-ויראלית. זה כולל את ההתמקדות של נתרן טאורוחולאט cotransporting פוליפפטיד (NTCP) קשירה, היווצרות cccDNA, שעתוק, והרכבה ויראלית המבוססת על imHC או HepaRG כמו תאים מארחים. כאן, בדיקת עיכוב הכניסה HBV השתמשה בכורכומין כדי לעכב פונקציות קשירה והובלה של HBV באמצעות NTCP. המעכבים הוערכו עבור זיקה מחייבת (KD) עם NTCP באמצעות קלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) – כלי אוניברסלי לבדיקת תרופות HBV המבוסס על פרמטרים תרמודינמיים.
Introduction
זיהום בנגיף הפטיטיס B (HBV) נחשב למחלה מסכנת חיים ברחבי העולם. זיהום HBV כרוני עמוס בסיכון לשחמת הכבד וקרצינומה הפטוצלולרית1. הטיפול הנוכחי נגד HBV מתמקד בעיקר בכניסה לאחר הנגיף באמצעות אנלוגים גרעיניים(t)IDE (NAs) ואינטרפרון-אלפא (IFN-α)2,3. הגילוי של מעכב כניסה HBV, Myrcludex B, זיהה מטרה חדשה לחומרים נגד HBV4. השילוב של מעכבי כניסה ו-NAs ב-HBV כרוני הפחית משמעותית את העומס הנגיפי בהשוואה לאלה המכוונים לשכפול נגיפי בלבד 5,6. עם זאת, המודל הקלאסי של הפטוציטים להקרנה של מעכבי כניסה HBV מוגבל על ידי רמות נמוכות של קולטנים נגיפיים (נתרן טאורוחולאט cotransporting polypeptide, NTCP). ביטוי יתר של hNTCP בתאי הפטומה (כלומר, HepG2 ו- Huh7) משפר את זיהום HBV 7,8. אף על פי כן, קווי תאים אלה מבטאים רמות נמוכות של אנזימים מעכלים של תרופות בשלב I ו-II ומפגינים חוסר יציבות גנטית9. מודלים של הפטוציטים שיכולים לסייע במיקוד מנגנונים מובחנים של תרכובות אנטי-HBV מועמדות כגון כניסה טרום-ויראלית, קשירת NTCP וכניסה ויראלית יזרזו את הזיהוי והפיתוח של משטרי שילוב יעילים. המחקר על פעילות אנטי-HBV של כורכומין הבהיר את עיכוב כניסת הנגיף כמנגנון חדש בנוסף להפרעה לאחר כניסת הנגיף. פרוטוקול זה מפרט מודל מארח להקרנה של מולקולות כניסה נגד HBV10.
המטרה של שיטה זו היא לחקור תרכובות אנטי-HBV מועמדות לעיכוב כניסה נגיפית, במיוחד חסימת קשירת NTCP והובלתו. מכיוון שביטוי NTCP הוא גורם קריטי לכניסה וזיהום של HBV, ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול ההבשלה של הפטוציטים כדי למקסם את רמות NTCP11. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להבדיל בין ההשפעה המעכבת על כניסת HBV כעיכוב של חיבור HBV לעומת עיכוב של הפנמה. בדיקת ספיגת החומצה הטאורוכולית (TCA) שונתה גם היא באמצעות שיטה מבוססת ELISA במקום רדיואיזוטופ כדי לייצג הובלת NTCP12,13. האינטראקציה בין הקולטן לליגנד אושרה על ידי המבנים התלת-ממדיים שלהם14,15. ניתן להעריך את העיכוב של פונקציית NTCP על ידי מדידת פעילות ספיגת TCA16. עם זאת, טכניקה זו לא סיפקה עדות ישירה לקשירת NTCP למעכבי המועמדים. לכן, ניתן לחקור את הקשירה באמצעות טכניקות שונות, כגון תהודת פלסמוןפני השטח 17, ELISA, בדיקת הסטה תרמית מבוססת פלואורסצנציה (FTSA)18, FRET 19, AlphaScreen, ושיטות שונות אחרות20. בין טכניקות אלה, ITC הוא תקן מטרה בניתוח מחייב מכיוון שהוא יכול לצפות בספיגת חום או פליטה כמעט בכל תגובה21. זיקת הקשירה (KD) של NTCP ותרכובות מועמדות הוערכה ישירות באמצעות ITC; ערכי זיקה אלה היו מדויקים יותר מאלו שהושגו באמצעות מודל החיזוי של סיליקו 22.
פרוטוקול זה מכסה טכניקות בהבשלת הפטוציטים, זיהום HBV והקרנה למעכבי כניסה HBV. בקצרה, פותח מודל הפטוציטים המבוסס על קווי תאים imHC ו- HepaRG. התאים בתרבית התמינו להפטוציטים בוגרים תוך שבועיים. העלייה ברמות NTCP זוהתה באמצעות PCR בזמן אמת, כתם מערבי וציטומטריה של זרימה11. הפטיטיס B virion (HBVcc) הופק ונאסף מ- HepG2.2.15. ה-imHC או ה-HepaRG המובחנים (d-imHC, d-HepaRG) טופלו באופן מניעתי עם המועמדים נגד HBV שעתיים לפני החיסון ב-HBV virion. התוצאה הצפויה של הניסוי הייתה זיהוי הסוכנים המפחיתים את ה-HBV התאי ואת ההדבקה. פעילות אנטי-NTCP הוערכה באמצעות בדיקת קליטת TCA. ניתן לדכא את פעילות NTCP על ידי הסוכנים שקשרו באופן ספציפי את NTCP. טכניקת ITC שימשה כדי לחקור את ההיתכנות של קשירה אינטראקטיבית שיכולה לחזות מעכבים וחלבוני המטרה שלהם, ולקבוע את זיקת הקשירה (KD) של הליגנד לקולטן באמצעות אינטראקציות לא קוולנטיות של הקומפלקס הביומולקולרי23,24. לדוגמה, K D ≥ 1 × 103 mM מייצג כריכה חלשה, K D ≥ 1 × 106 μM מייצג כריכה בינונית, ו- K D ≤ 1 × 109 nM מייצג כריכה חזקה. ה- ΔG נמצא בקורלציה ישירה עם אינטראקציות מחייבות. בפרט, תגובה עם ΔG שלילי היא תגובה אקסרגונית, המציינת כי מחייב הוא תהליך ספונטני. תגובה עם ΔH שלילי מצביעה על כך שתהליכי הקשירה תלויים בקשרי מימן ובכוחות ואן דר ואלס. ניתן להשתמש הן בקליטת TCA והן בנתוני ITC כדי לסנן סוכני כניסה נגד HBV. התוצאות של פרוטוקולים אלה יכולות לספק בסיס לא רק לסינון נגד HBV אלא גם לאינטראקציה עם NTCP כפי שהיא מוערכת באמצעות זיקה מחייבת ופונקציית תחבורה. מאמר זה מתאר הכנה ואפיון של תאי מארח, תכנון ניסויי והערכה של הערך נגד HBV יחד עם זיקת קשירת NTCP.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהום HBV מתחיל באמצעות זיקה נמוכה קשירה לפרוטאוגליקנים של הפראן סולפט (HSPGs) על הפטוציטים25, ולאחר מכן קשירה ל- NTCP עם הפנמה לאחר מכן באמצעות אנדוציטוזה26. מכיוון ש-NTCP הוא קולטן חיוני לכניסת HBV, ניתן לתרגם קלינית את הכניסה ל-HBV להפחתת זיהום דה נובו , העברה מאם לילד (MTC…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת Mahidol והמחקר והחדשנות המדעית של תאילנד (TSRI) המוענקים בנפרד ל- A. Wongkajornsilp ו- K. Sa-ngiamsuntorn. עבודה זו נתמכה כספית על ידי המשרד הלאומי למחקר מדעי ומדיניות חדשנות באמצעות היחידה לניהול תוכניות לתחרותיות (מענק מספר C10F630093). A. Wongkajornsilp הוא זוכה במענק Chalermprakiat של הפקולטה לרפואה בית החולים סיריראג ‘, אוניברסיטת Mahidol. המחברים רוצים להודות למיס סאווין סימקאן (המרכז המצוין לגילוי תרופות, הפקולטה למדעים, אוניברסיטת מאהידול) על עזרתה בטכניקת ITC.
Materials
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 A91:D106flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
Referenzen
- Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
- Kim, K. -. H., Kim, N. D., Seong, B. -. L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
- Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
- Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
- Mak, L. -. Y., Seto, W. -. K., Yuen, M. -. F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
- Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
- Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
- Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
- Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
- Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
- Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
- Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
- Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
- Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
- Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
- Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
- Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
- Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
- Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
- Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
- Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
- Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
- Srivastava, V. K., Yadav, R., Misra, G. . Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. , 125-137 (2019).
- Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
- Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
- Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
- Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
- Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
- Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).
